Meting van BK-polyomavirus niet-coderende controle regio gedreven transcriptionele activiteit via Flowcytometrie

Het algemene doel van dit protocol is om BK-polyomavirus niet-codering controle regio gedreven transcriptie activiteit te meten door het meten van dubbele fluorescerende cellen via flow cytometrie. Het BK-polyomavirus kan ernstige pathologieën veroorzaken bij immuungecompromitteerde patiënten, vooral bij niertransplantatieontvangers. Echter, aangezien zeer effectieve antivirus zijn momenteel niet beschikbaar, methoden meten van de potentiële anti-virale impact van andere verbindingen zijn vereist.

Deze methode stelt virologen in staat om de impact van potentiële antivirale middelen die de BK-polyomavirus transcriptie activiteit gedreven door de niet-codering controle regio te analyseren. Deze test maakt het verder mogelijk om de invloed van herschikkingen op de promotoractiviteit te bestuderen in vergelijking met archetypische niet-coderingsgebieden. Het voordeel van het bestuderen van de virale promotor activiteit met een dubbele fluorescentie rapport is dat vroege en late genexpressie kan worden geanalyseerd in een wederzijds onafhankelijke manier.

Bovendien zijn de moeilijke perforatie van virusvoorraden en langdurige infectieuze celkweekexperimenten niet nodig omdat alleen doorgestemde en fluorescerende cellen worden geanalyseerd, ook geneesmiddelen die de levensvatbaarheid van cellen en perforatie verminderen, kunnen worden bestudeerd. Dit protocol volgt de richtlijnen van menselijk onderzoek zoals goedgekeurd door de ethische commissie van de medische faculteit van de Universiteit van Duisburg-Essen. De eerste stap is het verzamelen van bloedmonsters voor de isolatie van polyomavirus DNA.

Verzamel ten minste drie milliliter bloed in EDTA acquisitie buizen. Centrifugeren het monster op 2, 500 G gedurende 15 minuten en pipette het plasma in een nieuwe buis. Bereid 40 microliter eiwit SK in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis en voeg 400 microliters plasma door pipetting.

Isoleer het DNA met behulp van een DNA-vlek extractie kit zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Bereid de mastermix voor de pre-PCR met primerpaar A in een totaal volume van 50 microliters en gebruik het eerder geïsoleerde DNA. Verdeel 45 microliter van de master mix in de PCR buizen.

Voeg vijf microliter van het geïsoleerde DNA toe aan de PCR-buizen en voer de PCR uit met de reactieomstandigheden zoals afgebeeld in tabel drie. Herhaal denaturatie annealing en uitbreiding in 35 cycli. Voor geneste toepassing, gebruik primer paar B, herbergen van de beperking sites voor klonen.

Meng 10 microliter van het PCR-product met twee microliters van zesvoudige gel ladingkleurstof. Laad 10 microliter van de mix op een 1,5% agarose gel en voer de gel gedurende 30 minuten uit op 60 milliampère. Visualiseer de gel met behulp van een geschikt UV-documentatiesysteem.

Zuiver de PCR amplicons met behulp van een PCR zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant. Verteren de gezuiverde amplicons met de indicator beperking enzymen gedurende twee uur op 37 graden Celsius. Herhaal de zuiveringsstappen om de verteerde amplicons te zuiveren.

Tegelijkertijd ook verteren de plasmide ruggengraat. Analyseer de verteerde plasmid ruggengraat op een 0,8% lage mount agarose gel. Laat de gel niet op een hogere stroom dan 40 milliampère.

Visualiseer DNA-fragmenten met behulp van lange golf UV-licht en knip de ruggengraat gebogen met behulp van een schone scalpel. Vermijd lange UV-blootstellingstijden om DNA-schade te voorkomen. Hek voor het stuk flomel gel fragment in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis.

Verwarm de ruggengraat met lage modus agarose stuk gedurende 10 minuten op 65 graden Celsius om de gel stuk smelten en meng elke twee minuten door zachte vortexing. De gesmolten gel kan direct worden gebruikt voor ligatie. Ligate ruggengraat en de verteerde amplicon met behulp van T4 DNA ligase 's nachts op 16 graden Celsius.

Na de standaard kloonprocedure isoleert u het plasma-DNA. Voer beperking enzym spijsvertering uit om te controleren op positieve klonen en geviseerde fragmenten te visualiseren op een 1%agarose gel. Zaad 100, 000 HEK293T cellen per put van de 12 put plaat 24 uur voor de transfectie en incubaat 's nachts bij 37 graden Celsius, handhaven actieve proliferatie tijdens transfectie.

Cellen moeten ongeveer bij 80% samenvloeiing bij transfectie zijn. Plaats 250 microliter met verlaagde serummedia in steriele buis en voeg één microgram van elk gerapporteerd plasma-DNA toe en meng zachtjes door pipetting. Voeg drie microliters van het transfectiereagens toe aan het DNA-mengsel en meng voorzichtig door 15 minuten te pipetten en uit te broeden bij 22 graden Celsius.

Voeg het mengsel, drop-wise aan de put en voorzichtig verdelen om de put. Vervang na vier uur de supernatant door vers medium met de testmiddelen en oplosmiddelcontrole. In dit voorbeeld werden de mTOR-remmers INK-128 en rapamycine gebruikt.

Incubeer bij 37 graden Celsius tot analyse. Controleer cellen op rode en groene fluorescentie onder de fluorescentiemicroscoop. Rode en groene fluorescentie komen overeen met respectievelijk de vroege en late BK-polyomavirus genexpressie.

72 uur na de transfectie, zorgvuldig streven naar de supernatant. Was de cellen twee maal met een milliliter koude PBS. Voeg voorzichtig 500 microliter trypsine toe en draai de plaat iets om voortijdige loslating van de cellen te voorkomen.

Deze stap is belangrijk om cel doubletten te voorkomen. Daarna wordt trypsine direct verwijderd met dezelfde pipetpunt. Broed de cellen minstens vijf minuten bij 37 graden Celsius.

Schors trypsin S-cellen opnieuw met één milliliter PBS met 3%FCS en breng de ophanging over in vooraf gelabelde FACS-buizen. Voeg DAPI toe met een concentratie van één microgram per milliliter voorafgaand aan facs-analyse. Analyseer de cellen met behulp van een stroomcytometer.

Meet voor elk monster ten minste 10.000 levende cellen. Initiële compensatie is essentieel om rode en groene signalen te onderscheiden om nauwkeurige resultaten te bereiken. De niet-coderingscontroleregenter werd versterkt gebruikend een geneste PROTOCOL PCR gebruikend het binnenste primerpaar dat de beperkingsplaatsen voor het klonen koestert.

De ampliconverificatie werd uitgevoerd via agarose gel elektroforese Terwijl de amplicons afgeleid van archetypische NCCR sequenties op een homogene grootteverdeling in de gel, die afkomstig zijn van herschikte NCV's met invoegingen en schrappingen, verschilden in hun grootte. De selectie van positieve klonen die de NCCR bevatten, werd geverifieerd door middel van een beperkingsanalyse. Het kleine spacer gebied werd vervangen door de grotere NCCR fragmenten die wijzen op positieve klonen.

Plasmide DNA geïsoleerd van geverifieerde klonen werden verzonden voor pyrosequencing. In dit voorbeeld zijn de verwijdering in het P-blok en de vervanging in O-blok gedetecteerd. HEK293T cellen werden van voorbijgaande aard vervangen met het respect voor te rapporteren constructie en NCCR activiteit werd gecontroleerd door een fluorescentie microscopie.

Rode en groene fluorescerende fluorescerende respectievelijk vroege en late BK-polyomavirus genexpressie. De eerste NCCR toonde een sterke late genexpressie, terwijl het tweede voorbeeld een relatief sterke vroege maar matige late genexpressie had. DAPI negatieve cellen werden gated en een stip plot werd gemaakt met eGFP versus tdTomato.

Zowel negatieve als positieve voor tdTomato of eGFP werden in de analyse opgenomen. Gemiddelde fluorescentie intensiteiten werden afgeleid van elke test kloon. In dit voorbeeld verminderde de behandeling met de dubbele mTOR-remmer INK128 de tdTomato MFI aanzienlijk, wat betekent dat vroege expressie werd geremd.

Deze methode maakt het mogelijk om momenteel gebruikte en andere verbindingen te identificeren om het BK-polyomavirus te detecteren door middel van transcriptieactiviteit. In de vroege genexpressie bepaalt dit beslist de virale implicatie. Remmende druppels kunnen worden beschouwd als middelen voor de immuungecompromitteerde patiënten in het geval van de REACT-polyomavirus reactivering.