Geïnduceerde differentiatie van M cel-achtige cellen in menselijke stamcel-afgeleide Ileal Enteroid monolayers

Een volledig begrip van de rol die de M-cellen spelen in darmhomeostase en immuunafweer ontbreekt, vanwege de zeldzaamheid van M-cellen in de darm. Geïnduceerde differentiatie van M-cellen in door menselijke darmstamcellen afgeleide culturen zal de studie van M-celontwikkeling en -functies mogelijk maken. Om de Transwell membranen te coaten, plaats je het gewenste aantal Transwells in een 24 putplaat, waardoor een tweekamersysteem ontstaat.

Verdun de extracellulaire matrix, of ECM, 25 keer in koud steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing. Voeg vervolgens 100 microliter koude verdunde oplossing toe aan elke bovenste kamer op het membraan. Bedek de 24 put plaat met een deksel, en plaats de plaat in een weefsel cultuur incubator op 37 graden Celsius gedurende twee uur om de ECM stolling op het mem.

Na twee uur, verwijder de plaat uit de couveuse, en plaats in een weefsel cultuur kap. Met behulp van steriele pincetten, omkeren elke Transwell om voorzichtig te verwijderen resterende oplossing. Laat de membranen aan de lucht drogen in de kap met het deksel open terwijl de cellen worden verzameld.

Verwijder de plaat van ileal enteroïden uit de couveuse en verwijder voorzichtig de kweekmedia uit elke put door vacuümaspiratie of met een pipet. Om de ECM te breken, voeg 500 microliter ijskoude 0,5 millimolar EDTA toe aan elke put met ileale enteroïden die in ECM zijn opgehangen. Pipet op en neer krachtig met een P1000 pipetter set op 500 microliters te breken ECM, waardoor het vrijgeven van ileal enteroids in de oplossing.

Verzamel de oplossing van elke put in 15 milliliter conische buizen. Pellet de cellen in een centrifuge op 140G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Pellet moet zichtbaar zijn, maar kan gemakkelijk worden losgemaakt, dus langzaam verwijderen van de supernatant door vacuüm aspiratie of met een pipet.

Om strakke verbindingsverbindingen te verteren en de ileal enteroïden in enkele cellen op te splitsen, resuspend de pellet in 500 microliters van kamertemperatuur trypsine per elke vijf verzamelde putten. Met behulp van een P1000 pipetter, pipet op en neer om de klonten te desaggen te desplitseren. Incubeer de buizen in een 37 graden Celsius waterbad gedurende vijf minuten of minder.

Voeg een milliliter geavanceerde DMEM F-12 toe met 10% FPS per 500 microliter trypsine om de trypsine te activeren. Pipet op en neer met een P1000 ingesteld op 500 microliters ten minste 50 keer tegen de zijkant van de conische buis om verder te desaggen resterende klonten in enkele cellen. Plaats een 40 micron cel zeef over een 50 milliliter conische buis, en voeg een milliliter van geavanceerde DMEM F-12 met 10% FPS nat de cel zeef.

Pipette de eencellige suspensie van de 15 milliliter conische op de zeef. Was de zeef met een milliliter geavanceerde DMEM F-12 met 10% FPS. Breng de cellen die ging door de cel zeef van de 50 milliliter conische buis in een nieuwe 15 milliliter conische buis.

Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de cellen in de nieuwe buis van 15 milliliter op 400G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. De celpellet moet zichtbaar zijn.

Verwijder voorzichtig de supernatant met een pipet, opnieuw het opslaan van de supernatant in het geval de pellet wordt losgemaakt. Resuspend de cel pellet in MCMGF plus met 10 micromolar Y27632. Zorg ervoor dat de ECM-gecodeerde membranen volledig zijn gedroogd, zoals beoordeeld door het oog.

Was de bovenste kamer met 200 microliter van MCMGF plus. Voeg vervolgens 200 microliter celoplossing toe aan elke bovenkamer. Voeg 700 microliter MCMGF plus met 10 micromolar Y27632 toe aan elke onderste kamer.

Plaats de plaat in een 37 graden Celsius weefselkweek incubator met 5%CO2. Na een dag van groei, verwijder de media uit de bovenste kamer, en vervangen door 200 microliters van verse MCMGF plus om groei van meerdere cellagen te voorkomen. Zodra monolagen zijn ongeveer 80%confluent, meestal tussen dagen een tot drie na het zaaien, vervangen basilateral media met differentiatie media voor controle putten, of met M cel media voor M cel inductie putten.

Vervang de media in de bovenkamer door differentiatiemedia voor beide voorwaarden. Als u M-celdifferentiatie wilt verifiëren door QRTPCR, verwijdert u eerst de media uit de boven- en onderkamers. Was de bovenste kamer twee keer voorzichtig met 300 microliters kamertemperatuur PPS.

Voeg 300 microliter TRIzol toe aan elke bovenkamer en broed vijf minuten op kamertemperatuur. Ondertussen, label micro centrifuge buizen voor elke put, en voeg 700 microliters van TRIzol aan elke buis. Verzamel celhomogenaat door voorzichtig op en neer te pipetten drie keer met een P1000, en breng de inhoud in overeenkomstige microcentrifuge buizen.

Vortex voor vijf seconden te mengen. Bewaar de monsters drie minuten op kamertemperatuur en ga vervolgens verder met standaard QRTPCR-protocollen of bewaar monsters bij negatieve 80 graden Celsius. Om M-celdifferentiatie door immunofluorescentie te verifiëren, moet u eerst de media uit de bovenkamer verwijderen.

Was voorzichtig twee keer met 300 microliters kamertemperatuur PBS. Voeg 100 microliter kamertemperatuur 4%PFA in PBS toe aan de bovenkamer. Bedek de plaat met folie en laat 25 minuten staan bij kamertemperatuur.

Na het verwijderen van de PFA, was de bovenste kamer drie keer met 300 microliters van kamertemperatuur PBS. Incubeer de monolagen met 100 microliter van 5%BSA opgelost in PBS gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur om de monolagen te blokkeren voordat de oplossing wordt verwijderd. Bereid GP2 primaire antilichaam oplossing in een procent BSA in PBS bij een verdunning van een tot 100, en voeg 100 microliter per goed.

Vlek gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker, voordat u de oplossing verwijdert. Was de bovenste kamer drie keer met 300 microliter kamertemperatuur PBS. Bereid een secundaire vlekoplossing van fluorescerend gelabelde geit anti-muis IgG phalloidin en DAPI, en voeg 100 microliters per put toe.

Vlek gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was de putten drie keer met 300 microliter PBS. Plaats vervolgens een vijf microliter druppel montageoplossing op een glazen schuif.

Haal de put uit de 24 putplaat en omk. Tijdens het verwijderen van het membraan uit de Transwell moet het membraan volledig vlak blijven. Hobbels in het membraan voorkomen een stevige afdichting op de glazen schuif en kunnen de beeldkwaliteit sterk beïnvloeden.

Om succes te garanderen, zorgvuldig snijd het membraan uit de put met behulp van een scherpe scalpel. Plaats het membraan met de cellen naar boven op de druppel van de montageoplossing op de glazen schuif. Voeg 10 microliter montageoplossing toe aan de bovenkant en het midden van het membraan en plaats er een afdeksel bovenop om het membraan tussen de glazen schuif en de afslag slip te verzegelen.

Droog de glijbanen op kamertemperatuur in het donker gedurende 24 uur. M-cellen worden gedetecteerd door oppervlakte-expressie van GP2 door immunofluorescenten. Typisch, in een confluent monolayer, een tot vijf M cellen worden waargenomen in een bepaalde microscoop veld op 40X vergroting door dag zes tot en met acht na het zaaien in monsters behandeld met RANKL en TNF alpha.

Geen GP2 expressie wordt gezien in de onbehandelde monsters. De orthogonale weergave van het XZ-vlak bedekt met een phalloidinsonde toont actinstructuren rond elke cel en GP2-expressie op het apicale oppervlak van M-cellen. Dit model recapituleert de lage frequentie van M-cellen gevonden in de menselijke darm.

Om te bepalen of de M-cellen die in dit model zijn ontwikkeld, in staat zijn om zich aan IgA te binden, wordt de aanwezigheid van IgA op M-cellen gevisualiseerd met behulp van een fluor geconjugeerd secundair antilichaam dat de zware keten van menselijk serum IgA herkent. M-cellen die een uur lang met IgA zijn behandeld, hebben IgA gebonden aan het apicale oppervlak, terwijl M-cellen in controleputten die alleen met het secundaire antilichaam tegen IgA zijn behandeld, geen detecteerbaar signaal hebben. Verder bindt IgA zich specifiek aan het apicale oppervlak van M-cellen en wordt niet gebonden bevonden aan cellen die geen GP2-oppervlaktevlek hebben.

Bovendien hebben M-cellen karakteristiek kortere dichte actin op hun apicale oppervlak. Overschakelen naar RANKL TNF alpha aangevuld differentiatie media wanneer de monolagen zijn ongeveer 80%confluent, is de sleutel tot het bereiken van een goede M cel differentiatie. Deze techniek zal onderzoekers in staat stellen om vragen met betrekking tot M celontwikkeling te verkennen, evenals gastheer pathogene interacties en drugstransport studies waarbij M cellen.