Geactiveerde kruisgebonden agarose voor de snelle ontwikkeling van Affiniteits chromatografie harsen-antilichamen vangen als een casestudy

Monoklonale antilichamen domineren de biofarmaceutische markt en worden meestal gezuiverd door Protein A chromatografie. De volgens hars is een belangrijke kostenfactor tijdens de productie die de prijs van antilichaamgebaseerde therapieën beïnvloedt. Hier beschrijven we een nieuwe affiniteit ligand op basis van de fluorescerende eiwit dat wordt gelezen als een drager voor de lineaire epitoop van HIV neutraliserende antilichaam 2F5.

In het algemeen maakt onze methode het mogelijk om snel affiniteitschromatografie harsen te genereren die kunnen worden gebruikt voor het vangen van monoklonale antilichamen. We hebben dit vermogen aangetoond door het vastleggen van antilichaam 2F5 uit ruw plantenextract. We hebben de afvangomstandigheden en oplossingsbuffer geoptimaliseerd om de dynamische bindingscapaciteit en de herbruikbaarheid van de hars te verbeteren.

Onze hars maakt over het algemeen lossere omstandigheden dan Eiwit A en heeft het potentieel om de zuiveringskosten van monoklonale antilichamen te verlagen. Bovendien kan de hars gemakkelijk worden aangepast aan andere antilichamen die zich binden aan lineaire epitopen. Om deze procedure te beginnen, pas de concentratie van de voorbereide affiniteit ligand oplossing, zodat is in het bereik van 5 tot 15 gram per liter, zoals gedefinieerd door het ontwerp van experimenten.

Bewaar de oplossing op ijs totdat de koppelingsreactie klaar is. Vul vervolgens een twee milliliter spuit met de DFE-oplossing. En bereid een adapter voor om de spuiten op NHS-geactiveerde cross-link agarose kolommen met een bed volume van een milliliter monteren.

Voor elke 10 kolommen die worden gebruikt voor koppeling, bereid 30 milliliter deactivering oplossing, 30 milliliter lage pH-oplossing, en een milliliter opslag oplossing. Bereid vervolgens 20 milliliter van een millimolar zoutzuur in een buis. En broed het minstens 20 minuten op ijs.

Bereid een precisieschaal voor om de stroom door breuken te controleren voor alle stappen tijdens de koppelingsreactie. Open hierna een verzegelde door NHS geactiveerde kruisgekoppelde agarosekolom. Breng een druppel buffer aan op de adapterinlaat, om te voorkomen dat er lucht in de kolom komt.

Monteer de spuitadapter op de kolominlaat. Was de kolom met zes milliliter ijskoud een millimolar zoutzuur, met een stroomsnelheid minder dan een milliliter per minuut. Met behulp van een twee milliliter spuit, onmiddellijk injecteren 1,5 milliliter van DFE oplossing met een stroomsnelheid minder dan een milliliter per minuut.

En verzamel de stroom door de fractie op een precisieschaal voor latere analyse. Verzegel de kolom aan beide uiteinden en broed gedurende 15 tot 45 minuten, bij 22 graden Celsius. Vervolgens injecteren zes milliliter van de activeringsoplossing, gevolgd door zes milliliter lage pH-oplossing, met een stroomsnelheid van minder dan een milliliter per minuut, verwijder niet-covalent gebonden liganden uit de hars.

Injecteer zes milliliter van de activeringsoplossing en ontcubeer de kolom gedurende 15 minuten. Injecteer hierna zes milliliter lage pH-oplossing in de kolom. Gevolgd door zes milliliter van de activeringsoplossing.

Injecteer vervolgens nog eens zes milliliter lage pH-oplossing in de kolom. Injecteer twee milliliter opslagoplossing in de kolom en bewaar deze op vier graden Celsius. Bereid eerst 100 milliliter van het geklaarde plantenextract met 2F5, of het supernatant voor het voorkeurscelgebaseerde expressiesysteem, dat ook 2F5 bevat.

Vervolgens de balansbuffer en de illusiebuffer met een hoge ijzeren X-sterkte voorbereiden, zoals beschreven in het tekstprotocol. Spoel het chromatografiesysteem door met de buffers. Monteer een DFE-affiniteitskolom op het chromatografiesysteem.

En equilibrate met vijf CV van evenwichtsbuffer, bij een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Controleer de UV-absorptie op 280 nanometer. Laad vervolgens 80 milliliter van het geklaarde plantenextract, of het supernatant op de kolom met een stroomsnelheid van 5 milliliter per minuut.

Om een contacttijd van twee minuten te garanderen. Verzamel de stroom door monsters in twee milliliter fracties of doorbraak curve reconstructie. Bewaar de stroom door monsters op vier graden Celsius, als onmiddellijke monsteranalyse niet mogelijk is.

Na deze wasbeurt de kolom met 6CV van evenwichtsbuffer. Verzamel een monster aan het begin, midden en einde van de was. Verdun de MAB2F5 met vijf volumes van hoge ionische sterkte illusie buffer.

Verzamel de DFE-fractie wanneer het UV-signaal op 280 nanometer is toegenomen tot vijf milli-absorptie-eenheden boven de basislijn. Optimaliseer de illusiebuffer voor elk epitoop-antilichaampaar, zoals beschreven in het tekstprotocol. Het fusie-eiwit DFE komt tot uiting in transgene tabaksplanten, geteeld in een kas.

Het totale herstel van DFE is 23,5 milligram per kilogram. Met een zuiverheid van meer dan 90%De absolute hoeveelheid DFE geïmmobiliseerd op de hars neemt toe met de massa van DFE geïnjecteerd in de kolom, en plateaus op ongeveer 15 gram per liter, terwijl de koppeling opbrengst daalt voortdurend als meer DFE wordt geïnjecteerd. De DFE moleculen worden gezien om hun rode florescentie te behouden, zelfs na koppeling.

De kleurintensiteit komt overeen met de totale hoeveelheid geïmmobiliseerde DFE. Daarom kolomkleur kan worden gebruikt als een eenvoudige parameter voor kwaliteitscontrole om de koppelingsefficiëntie en kolomkwaliteit te schatten. Het recombinant 2F5-antilichaam wordt van voorbijgaande aard geproduceerd in Nicotiana benthamiana-planten die in een fytotron worden geteeld.

De vangst van 2F5 uit het ruwe plantenextract, wordt getest met behulp van affiniteitskolommen, gekoppeld aan ongeveer zeven milligram gezuiverde DFE. Een magnesiumchlorideconcentratie van 1,25 molair is voldoende om 2F5 uit de DFE-affiniteits hars te ontlasten met een terugwinning van bijna 100%en een zuiverheid van ongeveer 97%, vergelijkbaar met eiwit A-harsen. De DBC van de DFE affiniteit hars op 10%2F5 doorbraak, daalt lineair in de loop van de 25 cycli, tot ongeveer 15% van de oorspronkelijke waarde.

We gebruikten een ontwerp van experimenten aanpak om de koppeling capaciteit van onze affiniteit ligand te optimaliseren. Deze voorwaarden kunnen worden afgestemd voor andere liganden in de toekomst. Onze methode maakt gebruik van fluorescerend eiwit om een subcarriereiwit te rijgen voor de productspecifieke ligand.

Tegelijkertijd gewoon functies toevoegen als een visuele kwaliteitsindicator van de mobilisatieprocedure, het verstrekken van een onmiddellijke en intuïtieve feedback aan de exploitant.