Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

Er is een groeiende waardering voor de impact van de mechanische micro-omgeving op celsignalering en migratie. Noodzakelijk het gebruik van unieke, experimentele benaderingen om mechanische stimulatie te leveren aan individuele cellen. Deze techniek maakt het mogelijk om de mechanische micro-omgeving onder een cel in realtime te manipuleren.

Het toestaan van de observatie van mechanisch gereguleerde veranderingen in celmigratiegedrag en subcellulaire signaleringsgebeurtenissen. Het aantonen van de procedure met mij zal Nyla Naim, een post-doc en Johnathan Patterson, een technicus van ons laboratorium. Begin met het gebruik van een Chorono-1 om het glazen oppervlak van elke bodemdeksel gedurende 20 seconden te activeren, voordat onmiddellijk 50 microliters bind silane werkoplossing op elke afdeksel slip.

Laat de oplossing 10 minuten drogen voordat u de afdektol twee keer spoelt met 95% ethanol en twee keer met isopropanol. Laat vervolgens de afdekking ongeveer 20 minuten aan de lucht drogen. Voor fluorescerende micro-kraalafzetting, eerste sonicate de werkende micro-kraal oplossing voor een uur.

Plaats 15 minuten voor het einde van de sonicatie de geactiveerde afdekking verticaal in een keramische afdekselhouder en breng de houder gedurende drie minuten over in een plasmareiniger aan tafeltop voor een kamerluchtplasmabehandeling. Plaats vervolgens stukjes paraffinefilm in 60 milliliter petrischaaldeksels en plaats de hoes op de films, licht tikkend op elke cover slip om een goed contact tussen de film en de coverslip te garanderen. Voeg vervolgens 150 microliter van de werkkraaloplossing toe aan de bovenkant van elke coverslip en vervolgens onmiddellijk de ethanoloplossing vanaf de zijkant van de coverslips aan te sporen, waardoor de kralen op de coverslip blijven.

Om de Hydrogels onmiddellijk na hun voorbereiding te werpen, voeg je een 25 microliter druppel hydrogel-oplossing toe aan de geactiveerde kant van elke onderste coverlip, en draai je onmiddellijk de kralen bovenste coverslips, kraalzijde naar beneden, op de druppel. Laat de gels 30 minuten polymeriseren voordat u tangen gebruikt om de afdekken voorzichtig te verwijderen. Spoel vervolgens de gels af met drie, vijf minuten wasbeurten in verse 50 miliMoler Hepes per wasbeurt.

Om de Hydrogels oppervlakken te activeren, 1cubaat de gels in verse 50 miliMoler Hepes, aangevuld met 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, en onmiddellijk bloot de gels aan een ultraviolette boog lamp in een afgesloten gebied voor 90 seconden. Aan het einde van de activering, was de gels met drie, vijf minuten wast in verse Hepes, en behandel de geactiveerde Hydrogels met 20 microgram per milliliter fibronectine gedurende een uur op 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, aspirate de overtollige fibronectin oplossing, en was de gels drie keer in PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt.

Na de laatste wasbeurt, plaats de Hydrogels in een klein volume van PBS en steriliseren de gels gedurende 15 minuten onder ultraviolet licht in een weefselkweekkap. Was vervolgens de gels een keer in verse PBS. Voor celbeplating, zaad 2,1 keer 10 de vier van de cellen van belang in drie milliliter medium per Hydrogel en laat de cellen te hechten op 37 graden Celsius gedurende vier tot 18 uur.

Terwijl de cellen zijn evenwicht, gebruik maken van een micro-pipet trekker om een diameter van een millimeter te trekken door 100 millimeter lang borosilicaat glas micro-pipet, om een taper van meer dan twee millimeter die vermindert tot ongeveer 50 micrometer in diameter in de eerste millimeter te verkrijgen, en strekt zich uit tot een lange, parallelle 10 micro diameter buis in de laatste millimeter. Laad vervolgens de pipet in een microforge en vorm de pipet om een 15 micrometer afgestompte punt te hebben die is ingesloten aan het einde van een 250 micrometersectie, gebogen op ongeveer 35 graden engel van de rest van de pipet. De geschatte diameter bij de bocht moet ongeveer 30 micrometer zijn om de punt sterkte te geven.

Plaats vervolgens een Hydrogel op het podium van een omgekeerde microscoop. Bedek het medium met minerale olie en selecteer de 10x doelstelling. Steriliseer de bereide micropipet met de 70%alcohol.

Steek vervolgens in de micropipet houder met de haak gericht in de richting van de schotel, en gebruik de cursus manipulator om de pipet lager totdat de haak net raakt het oppervlak van de vloeistof. Focus de microscoop op de cellen die aan de bovenkant van de gel zijn vastgehangen, en zorg ervoor dat het doel geen gevaar is om het monster of de fase te raken, breng de focus boven de gel om de punt van de micropipet te vinden. Draai de pipet totdat de punt loodrecht op het brandpuntsvlak staat, zodat de afgestompte punt van de micropipet naar beneden wijst en zich indien nodig opnieuw op de punt van de pipet richt.

Focus terug naar de cellaag om te meten hoe ver de pipet is van het geloppervlak, en focus terug naar een vlak dat deel-weg tussen de gel en de punt van pipet. Laat vervolgens de pipet langzaam zakken om het middenpuntvlak te bereiken en verhoog de vergroting tot die welke in het experiment zal worden gebruikt, voordat u de pipet verlaagt totdat deze net boven het oppervlak van de Hydrogel zweeft. Voor micro-manipulator kalibratie, beeld een gebied verstoken van cellen, een gebied met kralen, maar geen manipulatie, met de pipet boeiende de gel, en met de ingeschakelde pipet trekken van de gel.

Gebruik vervolgens afbeelding J om de velden geen kralen te vergelijken met de beadvelden zonder betrokkenheid, de kraalvelden met de ingeschakelde gel en de getrokken gel om de relatieve kraalverplaatsingen en kracht te berekenen die op de gels worden toegepast. Als u een durotaxis-test wilt uitvoeren, controleert u gedurende 30 minuten een groep cellen om cellen te identificeren die op een gerichte manier bewegen. Selecteer een cel die gestaag in één richting beweegt en controleer de cellen van de gewenste framesnelheid gedurende nog eens 30 minuten.

Plaats vervolgens de pipet ongeveer 50 micrometer voor de nabije kant van de voorrand van de geselecteerde cel en verplaats de micromanipulator zodanig dat de gel orthogonaal wordt vervormd naar de rijrichting van de cel. Observeer vervolgens de cel na verloop van tijd als het reageert op de acute, lokale gradiënt van Hydrogel stijfheid. Met behulp van deze techniek zoals aangetoond, rat embryonale fibroblasten bewegen in de richting van de verhoogde stijfheid in gradiënten toegepast door een glazen micro-pipet.

Rat embryonale fibroblastcellen, die van voorbijgaande aard vinculinspanningssensor uitdrukken op 125 kilopascal polyacrylamide gels tonen ook de vorming van brandpuntsverklevingen in de richtingen van het traject gedurende een periode van 40 minuten. Forster Resonance Energy Transfer analyse blijkt dat vinculin gelokaliseerd op focale verklevingen ervaart een onmiddellijke verandering in spanning, wanneer gepresenteerd met een acute durotactische stimulatie. Uitbreiding van het nut van deze test om de observatie van subcellulaire signalering gebeurtenissen, in reactie op durotactische stimulatie.

Als u meerdere pogingen doet om een cel uit te rekken, of als de microneedle glijdt tijdens de test, opnieuw beginnen met een nieuwe cel om te voorkomen dat het geven van meerdere, variabele, mechanische stimuli. Naast het nut voor het testen van durotaxis, kan deze techniek worden gecombineerd met genetische benaderingen, zoals biosensoren, RNAI, of genbewerking om te helpen de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij mechanotransductie af te bakenen.