Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie
1 november 2021
Dit protocol heeft tot doel de dynamische parameters (uitsteeksels, retracties, ruches) van uitsteeksels aan de rand van zich verspreidende cellen te meten.
Van de celranduitsteekseltest is aangetoond dat deze direct correleert met celmigratie. Daarom kan het worden gebruikt als een voorlopige methode voor het identificeren van kritieke eiwitten en signaleringsmechanismen die betrokken zijn bij de beweeglijkheid van cellen. De methode is snel, eenvoudig, kosteneffectief en vereist geen fluorescerende etikettering of het gebruik van een dure fluorescerende microscoop.
Michal Gendler, een student uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Voeg twee milliliter van een normale zoutzuuroplossing toe in het midden van een glazen bodemschaal en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was het gerecht drie keer met twee milliliter PBS.
Verdun fibronectine met een concentratie van 10 microgram per milliliter in PBS en voeg 200 microliter van de verdunde oplossing toe aan de glazen middenschaal. Incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Bereid 1% BSA-oplossing en PBS voor en voer deze door een filter van 0,2 micrometer.
Denatureer de oplossing door gedurende 30 minuten te broeden bij 70 graden Celsius in een voorverwarmd waterbad. Was de gecoate glazen bodemschaal drie keer met twee milliliter PBS. Voeg twee milliliter gedenatureerde BSA-oplossing toe en incubeer het gerecht gedurende een uur bij 37 graden Celsius.
Was de glazen schaal drie keer met twee milliliter PBS. Vóór 16 tot 18 uur experiment met 0,7 miljoen cellen per weefselkweekplaat met een diameter van 10 centimeter om 70 tot 80% confluentie te bereiken. Voeg de volgende dag twee milliliter trypsine-oplossing toe aan de weefselkweekplaat en incubeer gedurende twee tot drie minuten totdat de cellen losraken.
Voeg vijf milliliter van het medium toe om de trypsine te inactiveren. Tel met behulp van een hemacytometer de cellen en plaat 20.000 cellen in twee milliliter van het volledige medium in een onderste schaal. Incubeer vervolgens de schaal met vergulde cellen in een incubator gedurende 15 minuten.
Schakel de verwarmingseenheid in en stel deze een uur voor de beeldvorming in op 37 graden Celsius. Schakel ook de kooldioxide-eenheid in en stel deze in op 5% 10 minuten voordat u de beeldvorming uitvoert. Schakel de microscoop en camera in.
Schakel de computer in en open de microscoopacquisitiesoftware. Stel de vergroting in op een 40X droog lensfasecontrast. Stel de totale filmduur in op 10 minuten met een tijdsinterval van vijf seconden.
Plaats na 15 minuten incubatie de glazen bodemschaal met aangehechte cellen in een adapter en bevestig deze. Plaats de adapter met de schotel in de sleuven in de microscooptrap. Haal het deksel van de schotel eraf, plaats het deksel van de kooldioxide en open de kooldioxideklep.
Zoek een geschikte cel voor beeldvorming. Begin met filmacquisitie nadat je je op de cel hebt gericht. Om de beeldanalyse uit te voeren, selecteert u het rechte gereedschap in de beeldanalysesoftware en maakt u acht lijnen van 20 willekeurige eenheden loodrecht op de uitsteeksels in een radiale opstelling op elke 45 graden, inclusief lamellen en celrand.
Ga in de hoofdwerkbalk naar afbeelding, selecteer Stapels en klik vervolgens op Reslice om een kymograafafbeelding te genereren die de beweging van afzonderlijke punten in het celmembraan beschrijft. Gebruik de kymograafafbeeldingen om het aantal uitsteeksels, retracties en ruches in elk van de acht gebieden in de cel gemarkeerd door de rasterlijnen te extraheren en handmatig te tellen. Deze getallen vertegenwoordigen de frequentie van uitsteeksels, terugtrekkingen en ruches per 10 minuten.
Bepaal de uitsteeksel persistentie, afstand en snelheid door kymografie analyse. Om de uitsteekselafstand te bepalen, trekt u loodrechte lijn van de basis van het uitsteeksel naar de hoogste top van het uitsteeksel. Druk op M om de lengte van de lijn in pixels te meten en ervoor te zorgen dat de pixel-micrometerverhouding bekend is om de lengte in micrometers om te zetten.
Kwantificering van uitsteeksels, reacties en ruches werd handmatig uitgevoerd per 10 minuten en de gemiddelde frequentie verkregen voor uitsteeksels en retracties was 5,1 en 2,1 voor ruches. De representatieve kymograaf had een uitsteekselafstand van ongeveer 4,8 micrometer en een uitsteekseltijd van ongeveer 0,6 minuten. Er wordt een voorbeeld weergegeven van een cel die van de analyse moet worden uitgesloten.
Uit de kymografie-analyse bleek dat de cel niet aanwezig was in de verspreidingsfase en geen duidelijke membraanuitsteeksels vertoonde. Het belangrijkste is om de juiste cellen te kiezen voor beeldvorming. Een goede cel moet zich in de verspreidingsfase bevinden en mag andere cellen niet aanraken om cel-celcommunicatie en signalering te voorkomen.
De methode kan worden gebruikt als een voorlopig hulpmiddel voor het testen van cytoskeletale dynamica waarbij celmotiliteit betrokken is voordat wordt besloten om meer resultaten uit te voeren die celmigratietests vereisen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een celrand-uitsteekseltest om de dynamische parameters van zich verspreidende cellen te onderzoeken, inclusief uitsteeksels, instroom en ruiten. Deze methode is bijzonder belangrijk omdat het correleert met celmigratie, wat helpt bij het identificeren van cruciale eiwitten en signaalmechanismen die betrokken zijn bij celbeweeglijkheid.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Onderzoeksgebied
- Celmigratie
- Celbeweeglijkheid
- Cytoskeletaal dynamisch
Achtergrond
- Er bestaat een correlatie tussen celrand-uitsteeksels en celmigratie.
- De test is eenvoudig, kosteneffectief en vereist geen fluorescente markering.
- Inzicht in uitsteeksels kan inzicht geven in cellulair gedrag en mechanismen die motiliteit aandrijven.
Gebruikte methoden
- Celrand-uitsteekseltest
- Hechtende cellen op een glazen bodemschaal
- Kymografie-analyse voor het beoordelen van uitsteeksels
Belangrijkste resultaten
- Gemiddelde frequentie van uitsteeksels was 5,1 per 10 minuten, met ruiten bij 2,1.
- Kymografie-analyse onthulde een uitsteeksel-afstand van ongeveer 4,8 micrometer.
- Bepaalde de belangrijkheid van het kiezen van geschikte cellen in de verspreidingsfase voor nauwkeurige resultaten.
Conclusies
- De studie introduceert een toegankelijke test om celbeweeglijkheidsdynamica te beoordelen.
- Deze methode dient als voorlopig beoordelingsinstrument voordat complexere migratietests worden ondernomen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Cell-edge protrusion dynamics serve as an early, predictive readout of cell motility, enabling rapid assessment of cytoskeletal regulators before committing to resource-intensive migration assays. This method supports target validation by linking molecular perturbations to functional membrane dynamics, providing mechanistic de-risking in discovery workflows. Its label-free, cost-effective design facilitates high-throughput screening of signaling pathways relevant to wound healing, immune response, and cancer metastasis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures protrusion frequency, persistence, distance, and velocity to interrogate therapeutic hypotheses on actin regulators and motility pathways.
- Operational Value: Enables rapid, label-free screening of protein knockdowns or inhibitors affecting cytoskeletal dynamics.
- Predictive Value: Correlates protrusion dynamics with cell migration, supporting go/no-go decisions based on early phenotypic readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative kymograph-derived metrics (protrusion count, distance, velocity) for standardized comparison across experimental conditions.
- Operational Value: Uses phase-contrast microscopy and accessible image analysis tools, reducing dependency on specialized equipment or fluorescent probes.
- Scalability: Supports multi-condition testing via radial sampling of eight membrane regions per cell, enhancing data robustness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges molecular target modulation to functional cellular behavior in disease-relevant systems like fibroblasts or immune cells.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic effects stem from altered protrusion dynamics rather than secondary cytotoxicity or adhesion defects.
- Biomarker Alignment: Protrusion parameters can serve as translational biomarkers when linked to in vivo motility or invasion phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic validation, acting as a bridge between biochemical screening and functional cell-based assays.
- Discovery Biology: Tests how genetic or pharmacological manipulations of actin regulators (e.g., Arp2/3, cofilin, Rho GTPases) impact protrusion dynamics as a proxy for motility.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., protrusions per 10 minutes, protrusion velocity) that enable comparison across compound libraries or genetic screens.
- Analytics: Kymography provides temporal and spatial resolution of membrane dynamics, allowing extraction of kinetic parameters critical for mechanistic modeling.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical models by validating that target hits produce consistent protrusion phenotypes in primary or disease-relevant cell lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, low-cost platform for repeated use across projects investigating cell motility in development, inflammation, or oncology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking molecular perturbations to quantifiable membrane dynamics.
- Operational Value: Eliminates need for fluorescent labeling and expensive imaging hardware, lowering assay barrier and increasing accessibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering targets early using a predictive, phenotypic anchor to cell migration.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concordance between protrusion dynamics and migratory potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, kymograph generation, and manual or semi-automated protrusion analysis.
- Depends on phase-contrast microscopy and image analysis software capable of reslice and kymograph generation.
- Necessitates standardization of cell seeding density, substrate coating (fibronectin/BSA), and environmental controls (37°C, 5% CO2) for reproducibility.
- Requires training to identify appropriate spreading-phase cells and avoid confluent or contacting cells that confound protrusion measurements.
- Limited to 2D substrate-associated spreading; may not fully capture 3D invasion or confined migration phenotypes.
