Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie

Van de celranduitsteekseltest is aangetoond dat deze direct correleert met celmigratie. Daarom kan het worden gebruikt als een voorlopige methode voor het identificeren van kritieke eiwitten en signaleringsmechanismen die betrokken zijn bij de beweeglijkheid van cellen. De methode is snel, eenvoudig, kosteneffectief en vereist geen fluorescerende etikettering of het gebruik van een dure fluorescerende microscoop.

Michal Gendler, een student uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Voeg twee milliliter van een normale zoutzuuroplossing toe in het midden van een glazen bodemschaal en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was het gerecht drie keer met twee milliliter PBS.

Verdun fibronectine met een concentratie van 10 microgram per milliliter in PBS en voeg 200 microliter van de verdunde oplossing toe aan de glazen middenschaal. Incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Bereid 1% BSA-oplossing en PBS voor en voer deze door een filter van 0,2 micrometer.

Denatureer de oplossing door gedurende 30 minuten te broeden bij 70 graden Celsius in een voorverwarmd waterbad. Was de gecoate glazen bodemschaal drie keer met twee milliliter PBS. Voeg twee milliliter gedenatureerde BSA-oplossing toe en incubeer het gerecht gedurende een uur bij 37 graden Celsius.

Was de glazen schaal drie keer met twee milliliter PBS. Vóór 16 tot 18 uur experiment met 0,7 miljoen cellen per weefselkweekplaat met een diameter van 10 centimeter om 70 tot 80% confluentie te bereiken. Voeg de volgende dag twee milliliter trypsine-oplossing toe aan de weefselkweekplaat en incubeer gedurende twee tot drie minuten totdat de cellen losraken.

Voeg vijf milliliter van het medium toe om de trypsine te inactiveren. Tel met behulp van een hemacytometer de cellen en plaat 20.000 cellen in twee milliliter van het volledige medium in een onderste schaal. Incubeer vervolgens de schaal met vergulde cellen in een incubator gedurende 15 minuten.

Schakel de verwarmingseenheid in en stel deze een uur voor de beeldvorming in op 37 graden Celsius. Schakel ook de kooldioxide-eenheid in en stel deze in op 5% 10 minuten voordat u de beeldvorming uitvoert. Schakel de microscoop en camera in.

Schakel de computer in en open de microscoopacquisitiesoftware. Stel de vergroting in op een 40X droog lensfasecontrast. Stel de totale filmduur in op 10 minuten met een tijdsinterval van vijf seconden.

Plaats na 15 minuten incubatie de glazen bodemschaal met aangehechte cellen in een adapter en bevestig deze. Plaats de adapter met de schotel in de sleuven in de microscooptrap. Haal het deksel van de schotel eraf, plaats het deksel van de kooldioxide en open de kooldioxideklep.

Zoek een geschikte cel voor beeldvorming. Begin met filmacquisitie nadat je je op de cel hebt gericht. Om de beeldanalyse uit te voeren, selecteert u het rechte gereedschap in de beeldanalysesoftware en maakt u acht lijnen van 20 willekeurige eenheden loodrecht op de uitsteeksels in een radiale opstelling op elke 45 graden, inclusief lamellen en celrand.

Ga in de hoofdwerkbalk naar afbeelding, selecteer Stapels en klik vervolgens op Reslice om een kymograafafbeelding te genereren die de beweging van afzonderlijke punten in het celmembraan beschrijft. Gebruik de kymograafafbeeldingen om het aantal uitsteeksels, retracties en ruches in elk van de acht gebieden in de cel gemarkeerd door de rasterlijnen te extraheren en handmatig te tellen. Deze getallen vertegenwoordigen de frequentie van uitsteeksels, terugtrekkingen en ruches per 10 minuten.

Bepaal de uitsteeksel persistentie, afstand en snelheid door kymografie analyse. Om de uitsteekselafstand te bepalen, trekt u loodrechte lijn van de basis van het uitsteeksel naar de hoogste top van het uitsteeksel. Druk op M om de lengte van de lijn in pixels te meten en ervoor te zorgen dat de pixel-micrometerverhouding bekend is om de lengte in micrometers om te zetten.

Kwantificering van uitsteeksels, reacties en ruches werd handmatig uitgevoerd per 10 minuten en de gemiddelde frequentie verkregen voor uitsteeksels en retracties was 5,1 en 2,1 voor ruches. De representatieve kymograaf had een uitsteekselafstand van ongeveer 4,8 micrometer en een uitsteekseltijd van ongeveer 0,6 minuten. Er wordt een voorbeeld weergegeven van een cel die van de analyse moet worden uitgesloten.

Uit de kymografie-analyse bleek dat de cel niet aanwezig was in de verspreidingsfase en geen duidelijke membraanuitsteeksels vertoonde. Het belangrijkste is om de juiste cellen te kiezen voor beeldvorming. Een goede cel moet zich in de verspreidingsfase bevinden en mag andere cellen niet aanraken om cel-celcommunicatie en signalering te voorkomen.

De methode kan worden gebruikt als een voorlopig hulpmiddel voor het testen van cytoskeletale dynamica waarbij celmotiliteit betrokken is voordat wordt besloten om meer resultaten uit te voeren die celmigratietests vereisen.