Name: Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Leer een celrand-uitsteekselassay om dynamische parameters van verspreidende cellen te meten met behulp van live-celmicroscopie en kymografie. Deze kosteneffectieve methode vereist geen fluorescentielabeling en helpt bij het identificeren van kritieke eiwitten en signaalmechanismen betrokken bij celmotiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies NIH MH115939, NS112121, NS105640 en R56MH122449-01A1 (aan Anthony J. Koleske) en van de Israel Science Foundation (subsidies nummer 1462/17 en 2142/21) (aan Hava Gil-Henn).

Alle methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Bar-Ilan University.
OPMERKING: Een stapsgewijze grafische weergave van de procedure die in deze sectie wordt beschreven, wordt weergegeven in figuur 1.
1. Celkweek
OPMERKING: De cellen die in het protocol worden gebruikt, zijn embryonale fibroblasten van muizen (MEF's) die zijn gegenereerd uit E11.5-13.5-embryo's van wild-type C57BL / 6-muizen. Primaire MEF's werden gegenereerd volgens het Jacks laboratoriumprotocol13. Cellen van vijf verschillende embryo's werden samengevoegd en vereeuwigd door infectie met een retrovirale vector die SV40 groot T-antigeen tot expressie bracht, gevolgd door selectie met 4 mM Histidinol gedurende 3 weken.
<ol><li>Kweekcellen in weefselkweekplaten die Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bevatten met 1 g/L glucose, 1% glutamine, 1% penicilline-streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS) (zie Materialentabel), in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 °C.</li>
	<li>Kweek de cellen tot 90% -95% confluentie en splits in een verhouding van 1: 5 elke 2-3 dagen.</li>
</ol>2. Vaatcoating met glazen bodem
OPMERKING: De glasbodemcoating moet in steriele omstandigheden in de weefselkweekkap worden uitgevoerd.
<ol><li>Voeg 2 ml 1N HCl-oplossing toe in het midden van een schaal met glazen bodem (Table of Materials) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT). OPMERKING: Deze fase is bedoeld om residu uit het glas te verwijderen dat de beeldvorming later kan onderbreken.</li>
	<li>Was de schotel met glazen bodem drie keer met elk 2 ml 1x PBS (Table of Materials).</li>
	<li>Verdun fibronectine (zie materiaaltabel) tot 10 μg/ml in 1x PBS. Voeg 200 μL van de verdunde fibronectine-oplossing toe aan het glazen midden van de schaal. Incubeer bij 37 °C (weefselkweekincubator) gedurende 1 uur. OPMERKING: Als alternatief kan de schotel met glazen bodem een nacht bij 4 °C op een vlakke ondergrond worden geïncubeerd.</li>
	<li>Bereid tijdens de incubatietijd van de fibronectinecoating 1% BSA-oplossing (Table of Materials) in 1x PBS, filtreer door 0,2 μm en denature door gedurende 30 minuten te incuberen bij 70 °C in een voorverwarmd waterbad.</li>
	<li>Was de gecoate schotel met glazen bodem drie keer met elk 2 ml 1x PBS.</li>
	<li>Voeg 2 ml gedenatureerde BSA-oplossing toe aan het glascentrum en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C (weefselkweekincubator). OPMERKING: Als alternatief kan de schotel met glazen bodem een nacht bij 4 °C op een vlakke ondergrond worden geïncubeerd.</li>
	<li>Was de schotel met glazen bodem 3 keer met elk 2 ml 1x PBS. OPMERKING: Incubatie van schalen met glazen bodem met fibronectine moet gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C worden uitgevoerd om het oppervlak goed te coaten. Kortere incubatietijd kan niet de juiste coating produceren, en als gevolg daarvan is het celfenotype mogelijk niet gerelateerd aan integrine-activering. De BSA-laag is inert en heeft geen invloed op de uitsteekseldynamiek en is bedoeld om vrije potentiële locaties voor integrine-onafhankelijke celadhesie te blokkeren. De BSA moet vóór de coating worden gedenatureerd om te voorkomen dat het celapoptose induceert, wat de dynamiek van de celrand kan beïnvloeden.</li>
</ol>3. Voorbereiding van cellen voor beeldvorming
<ol><li>Zestien tot achttien uur voor het experiment bereiken de cellen de volgende dag 70% -80% confluentie. Voor MEF's, plaat 0,7 x 106 cellen per weefselkweekplaat met een diameter van 10 cm per dag voordat het experiment wordt uitgevoerd. OPMERKING: Voor een succesvol uitsteekselexperiment is het belangrijk dat de cellen worden gebruikt tijdens hun logaritmische groeifase. Om dit te bereiken, moeten cellen 70% -80% samenvloeiing bereiken op de dag van het experiment. Een hogere dichtheid van cellen zal resulteren in een langere verspreidingstijd en/of belemmering van de hechting tijdens het experiment.</li>
	<li>Voeg op de experimentele dag 2 ml trypsine-oplossing (materiaaltabel) toe per weefselkweekplaat met een diameter van 10 cm en incubeer gedurende 2-3 minuten in een weefselkweekincubator totdat de cellen loskomen. Inactiveer trypsine door 5 ml van het volledige medium toe te voegen.</li>
	<li>Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en plaats 20.000 cellen in 2 ml van het volledige medium op een schaal met glazen bodem zoals hierboven gecoat (sectie 2). OPMERKING: Het aantal cellen voor plating is afhankelijk van de grootte en het type cellen. Voor grotere of meer verspreide cellen, plaat slechts 10.000 cellen om genoeg cellen te hebben voor beeldvorming. Het is belangrijk om afzonderlijke cellen te kiezen die elkaar niet raken, omdat cel-tot-celcontact het cel-intrinsieke verspreidingsgedrag kan veranderen.</li>
	<li>Incubeer de schalen met glazen bodem met vergulde cellen in de weefselkweekincubator gedurende 15 minuten. OPMERKING: Tijdens deze fase hechten cellen zich aan het fibronectinesubstraat en verspreiden zich erover. Bij het meten van uitsteeksels tijdens celverspreiding moeten cellen zich gedurende 15 minuten na plating en vóór beeldvorming kunnen verspreiden. Beeldvorming kan worden uitgevoerd binnen een tijdsvenster tussen 15 minuten tot ~ 1 uur na plating, en in elk geval voordat de cellen beginnen te migreren.</li>
</ol>4. Microscoop instelling en beeldvorming
OPMERKING: Er zijn verschillende live-cell microscopiesystemen beschikbaar. Het systeem dat hier wordt gebruikt is een Leica AF6000 omgekeerde microscoop uitgerust met CO2 - en verwarmingseenheden en is bevestigd aan een ORCA-Flash 4.0 V2 digitale CMOS-camera.
<ol><li>Zet de verwarmingseenheid ten minste 1 uur voor het afbeelden aan en stel deze in op 37 °C.</li>
	<li>Schakel de CO2-eenheid ten minste 10 minuten voor het afbeelden in en stel deze in op 5% CO2.</li>
	<li>Schakel de microscoop, camera en computer in.</li>
	<li>Open de microscoopacquisitiesoftware (zie Tabel met materialen). Kies de map om vastgelegde afbeeldingen op te slaan en typ een bestandsnaam. Sla elke film op als een nieuw bestand.</li>
	<li>Stel de vergroting in op een 40x droge lens, fasecontrast. Stel het tijdsinterval in op 5 s, totale filmduur 10 min.</li>
	<li>Na 15 minuten incubatie van de vergulde cellen plaatst u de schotel met glazen bodem met aangehechte cellen in de adapter en bevestigt u deze. Plaats de adapter met de schotel in de sleuf in het microscoopstadium.</li>
	<li>Haal het deksel van de schotel eraf en plaats in plaats daarvan het CO2-deksel . Open de CO2-klep . OPMERKING: Zorg ervoor dat het CO2-deksel schoon is voordat u het op de glazen schaal plaatst. Een vuile hoes vermindert de kwaliteit van films. Veeg de onderkant van het CO2-deksel schoon met een pluisvrij doekje gedrenkt in 70% ethanol om stof en vuil te verwijderen. Veeg een tweede keer af met een droog pluisvrij doekje.</li>
	<li>Bekijk de cellen en zoek een geschikte cel voor beeldvorming. Zorg ervoor dat de cel scherp is en begin met het aanschaffen van films.</li>
</ol>5. Beeldanalyse
OPMERKING: Beeldanalyse wordt als volgt uitgevoerd met ImageJ (Table of Materials):
<ol><li>Open de verworven film in ImageJ.</li>
	<li>Maak met het gereedschap Recht op de hoofdwerkbalk acht lijnen van 20 willekeurige eenheden die elk loodrecht staan op de uitsteeksels, inclusief de lamellen en de celrand, in een radiale opstelling om de 45°, zoals weergegeven in figuur 2A.</li>
	<li>Ga in de hoofdwerkbalk naar Afbeelding > stapels > Reslice. Dit levert een kymograafbeeld op, dat de beweging van enkele punten binnen het celmembraan beschrijft (figuur 2B). Deze actie moet voor elke regel van de acht regels afzonderlijk worden uitgevoerd.</li>
	<li>Extraheer en tel handmatig uit de respectieve kymograafafbeeldingen het aantal uitsteeksels, terugtrekkingen en ruches in elk van de acht regio's in de cel, gemarkeerd door de rasterlijnen. Deze getallen vertegenwoordigen de frequentie van uitsteeksels, terugtrekkingen en ruches per 10 minuten (figuur 2C, D). OPMERKING: Ruches kunnen worden onderscheiden van andere structuren op basis van hun donkere uiterlijk in fasecontrastmicroscopie en hun centripetale beweging, die begint bij de celrand en eindigt aan de rand van het cellichaam, die kan worden waargenomen in de verworven films. Van belang is dat bij het kwantificeren van uitsteeksel, terugtrekking en ruchefrequentie films moeten worden waargenomen als een controle voor kwantificering en vooral voor het definiëren van ruches.</li>
	<li>Bepaal de uitsteekselperistentie, afstand en snelheid door kymografie-analyse. Voor elk van de gegenereerde kymografen staat de X-as voor afstand en de Y-as voor tijd.</li>
	<li>Volg de stappen 5.6.1-5.6.2 om de uitsteekselafstand te meten.<ol>
<li>Teken een loodrechte lijn van de basis van het uitsteeksel naar de hoogste top van het uitsteeksel. Druk op M in ImageJ om de lengte van de lijn in pixels te meten.</li>
		<li>Als u de lengte van pixels naar μm wilt converteren, moet u ervoor zorgen dat de verhouding tussen pixel en μm bekend is. OPMERKING: De μm-pixelverhouding is de fysieke lengte van een pixel op de CCD-camera / totale vergroting. De pixelgrootte is kenmerkend voor elk type camera. Voor de camera die in dit onderzoek wordt gebruikt, is de pixelgrootte bijvoorbeeld 6,5 μm x 6,5 μm, de fysieke lengte 6,5 μm en de vergroting die we gebruikten is 40x. Daarom is de μm-pixelverhouding van onze camera 0,1625 μm/pixel. In de analyse zou voor een lijn in de lengte van 30 pixels de uitsteekselafstand 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm zijn (figuur 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Om de uitsteekseltijd (persistentie; de hoeveelheid tijd die een uitsteeksel doorbrengt voordat het wordt ingetrokken) te meten, volgt u de stappen 5.7.1-5.7.2.<ol>
<li>Teken een horizontale lijn van het begin van het uitsteeksel (van links naar rechts) naar het gebied van de hoogste piek. Druk op M in ImageJ om de lengte van de lijn in pixels te meten.</li>
		<li>Als u de lengte van pixels naar minuten wilt converteren, berekent u de verhouding tussen pixel en min. Deze waarde is afhankelijk van het interval tussen afbeeldingen. OPMERKING: In dit voorbeeld is het interval tussen afbeeldingen 5 s, de min/pixelverhouding 0,0833 en de horizontale lijnlengte 8 pixels. Daarom is de uitsteekseltijd 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Meet en bereken de retractietijd op dezelfde manier als de uitsteekseltijd voor een lijn die horizontaal is getekend aan de basis van het uitsteeksel van waaruit de piek van het uitsteeksel zich naar de basis aan de rechterkant bevindt (lijn X2 in figuur 3).</li>
	<li>Bereken de uitsteekselsnelheid door de uitsteekselafstand te delen door de uitsteekseltijd. Bereken de retractiesnelheid door de uitsteekselafstand te delen door de retractietijd. In dit voorbeeld wordt de uitsteekselsnelheid berekend als 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., en de retractiesnelheid is identiek omdat de lijn die de tijd vertegenwoordigt op dezelfde lengte is. OPMERKING: Bij het vergelijken van verschillende celtypen, d.w.z. cellen die wildtype en mutante constructies van hetzelfde eiwit tot expressie brengen, is het noodzakelijk om een geblindeerde analyse uit te voeren, zodat er geen vertekening wordt geïntroduceerd.</li>
</ol>

<ol><li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+embryonic+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li>
<li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li>
<li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+nucleation+and+elongation+factors%3A+mechanisms+and+interplay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li>
<li>Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+JM+%22The+Actin+Cytoskeleton+and+the+Regulation+of+Cell+Migration.+Colloquium+series+on+building+blocks+of+the+cell%3A+cell+structure+and+function%22">The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function</a>. , Morgan and Claypool Life Sciences, Morgan and Claypool Publishers. (2013).</li>
<li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li>
<li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibers--assembly%2C+dynamics+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).</li>
<li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li>
<li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li>
<li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED%2C+a+new+computer-assisted+motion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li>
<li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+between+Ena%2FVASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li>
<li>Jacks laboratory protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs">http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs</a> (2021).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187(2011).</li>
<li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Abl-related+gene+%28Arg%29+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li>
<li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li>
<li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li>
<li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+%28Arg%29+tyrosine+kinase+and+N-WASp%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li>
<li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te onthullen.

Cel-edge uitsteekseldynamiek, bestaande uit uitsteeksels, retracties en ruches, is zowel een vereiste als een potentiële snelheidsbeperkende gebeurtenis in celmotiliteit. Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode voor het meten van de dynamiek van celranduitsteeksels tijdens het verspreiden. Deze methode maakt beeldvorming met een korte tijd mogelijk, genereert een aanzienlijke hoeveelheid gegevens, vereist geen fluorescerende etikettering van cellen of dure fluorescerende microscopieapparatuur en kan worden g...

Celmigratie is een kritisch proces dat de ontwikkeling en functie van alle levende organismen regelt. Celmigratie vindt plaats in zowel fysiologische omstandigheden, zoals embryogenese, wondgenezing en immuunrespons, als bij pathologische aandoeningen, zoals kankermetastase en auto-immuunziekte. Ondanks verschillen in celtypen die deelnemen aan verschillende migratiegebeurtenissen, delen alle celmotiliteitsgebeurtenissen vergelijkbare moleculaire mechanismen, die bewaard zijn gebleven in de evolutie van protozoa tot zoogdieren, en omvatten ze gemeenschappelijke cytoskeletale controlemechanismen die de omgeving kunnen detecteren, reageren op signalen en celgedrag in reactie kunnen moduleren1.
Een eerste fase in celmigratie kan de vorming van zeer dynamische uitsteeksels aan de voorrand van de cel zijn. Achter het lamellipodium bevindt zich de lamellen, die actine koppelt aan myosine II-gemedieerde contractiliteit en adhesie aan het onderliggende substraat bemiddelt. Lamellipodia worden geïnduceerd door extracellulaire stimuli zoals groeifactoren, cytokines en celadhesiereceptoren en worden aangedreven door actinepolymerisatie, die de fysieke kracht levert die het plasmamembraan naar voren duwt2,3. Veel signalerende en structurele eiwitten zijn hierbij betrokken; onder hen zijn Rho GTPases, die coördinerend werken met andere signalen om actine-regulerende eiwitten te activeren, zoals het Arp 2/3-complex, WASP-familie-eiwitten en leden van de Formin- en Spire-families in lamellipodia2,4,5.
Naast actinepolymerisatie is myosine II-activiteit vereist voor het genereren van contractiele krachten op het lamellipodium en de voorste lamellen. Deze samentrekkingen, ook gedefinieerd als celrandterugtrekkingen, kunnen ook het gevolg zijn van depolymerisatie van dendritische actine aan de celrand en zijn van cruciaal belang voor het ontwikkelen van de lamellipodiale voorrand en het uitsteeksel in staat stellen de flexibiliteit van de extracellulaire matrix en andere cellen te voelen en de migratierichting te bepalen6,7,8 . Uitsteeksels van de celrand die zich niet aan het substraat kunnen hechten, vormen perifere membraanruches, plaatachtige structuren die op het ventrale oppervlak van lamellipodia en lamellen verschijnen en achteruit bewegen ten opzichte van de migratierichting. Omdat het lamellipodium zich niet aan het substraat hecht, vormt zich eronder een achterste lamellipodium en duwt het eerste lamellipodium mechanisch naar het bovenste ventrale oppervlak. De actinefilamenten in de ruche die vroeger evenwijdig aan het substraat waren, komen er nu loodrecht op te staan en de ruche bevindt zich nu boven het oprukkende lamellipodium. De ruche die naar achteren beweegt, valt terug in het cytosol en vertegenwoordigt een cellulair mechanisme voor het recyclen van lamellipodiaal actine9,10.
Hier beschrijven we een test voor het meten van celrand uitsteekseldynamiek. De uitsteekseltest maakt gebruik van time-lapse videomicroscopie om gedurende 10 minuten tijdens de verspreidingsfase van de cel een enkele celrand uitsteekseldynamiek te meten. Uitsteekseldynamiek wordt geanalyseerd door kymografen uit deze films te genereren. In principe geeft een kymograaf gedetailleerde kwantitatieve gegevens van bewegende deeltjes in een spatiotemporale plot om een kwalitatief begrip van de celranddynamica te verkrijgen. De intensiteit van het bewegende deeltje wordt uitgezet voor alle beeldstapels in een tijd versus ruimte plot, waarbij de X-as en de Y-as respectievelijk tijd en afstand vertegenwoordigen11. Deze methode maakt gebruik van een handmatige kymograafanalyse met ImageJ om gedetailleerde kwantitatieve gegevens te verkrijgen, waardoor informatie uit films en afbeeldingen kan worden opgehaald in geval van een lage signaal-ruisverhouding en / of hoge functiedichtheid, en de analyse van afbeeldingen die zijn verkregen in fasecontrastlichtmicroscopie of slechte beeldkwaliteit.
De celrand uitsteekseldynamiektest die hierin wordt beschreven, is een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve methode. Als zodanig, en omdat is aangetoond dat het direct correleert met celmigratie11,12, kan het worden gebruikt als een voorlopige methode voor het testen van cytoskeletale dynamica die betrokken is bij celmotiliteit voordat wordt besloten om meer middelen-veeleisende methoden uit te voeren. Bovendien maakt het ook kwantitatieve meting mogelijk van hoe genetische manipulaties (knock-out, knockdown of reddingsconstructies) van cytoskeletale eiwitten de cytoskeletale dynamiek beïnvloeden met behulp van een eenvoudig platform. De assay is een leerzaam model voor het onderzoeken van cytoskeletale dynamica in de context van celmigratie en kan worden gebruikt voor opheldering van de mechanismen en moleculen die ten grondslag liggen aan celmotiliteit.

<table><tbody><tr><td>10 cm celkweekplaten</td><td>Greiner</td><td>P7612-360EA</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle-medium (DMEM)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>01-055-1A</td><td>Medium bevat hoge glucose (4,5 g/L D-glucose)</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s fosfaatgebufferde zoutoplossing (1xDPBS)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine uit menselijk plasma, vloeibaar, 0,1%, geschikt voor celkweek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Schalenkoken met glazen bodem</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>35mm glazen bodem schaal, schaalgrootte 35 mm, putgrootte 20mm, #1.5 dekglas (0.16-0.19 mm).</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td></td><td>Gratis beschikbaar op: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td><td></td><td></td><td>Microscoop acquisitiesoftware uitgerust met een ORCA-Flash 4.0 V2 digitale CMOS</td></tr><tr><td>Leica AF6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Omgekeerd helderveldmicroscoop (40x, NA 1,3 ) uitgerust met fasecontrastoptiek, een incubator en CO2-eenheid met LAS AF acquisitiesoftware uitgerust met een ORCA-Flash 4.0 V2 digitale CMOS camera.</td></tr><tr><td>L-glutamine oplossing</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 V2 digitale CMOS camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine oplossing</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA oplossing B (0,25%), EDTA (0,05%)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-052-1A</td><td></td></tr></tbody></table>

cell-edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van live-cell microscopie

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

De ontwikkeling en homeostase van meercellige organismen zijn afhankelijk van gecoördineerde regulatie van celmigratie. Celmigratie is een essentiële gebeurtenis in de constructie en regeneratie van weefsels en is van cruciaal belang voor de embryonale ontwikkeling, immunologische reacties en wondgenezing. Ontregeling van de celmotiliteit draagt bij aan pathologische aandoeningen, zoals chronische ontstekingen en kankermetastase. Celmigratie, weefselinvasie, axon- en dendrietuitgroei beginnen allemaal met actinepolymerisatie-gemedieerde celranduitsteeksels. Hier beschrijven we een eenvoudige, efficiënte, tijdbesparende methode voor de beeldvorming en kwantitatieve analyse van celranduitsteekseldynamiek tijdens het verspreiden. Deze methode meet discrete kenmerken van celrandmembraandynamica, zoals uitsteeksels, retracties en ruches, en kan worden gebruikt om te beoordelen hoe manipulaties van belangrijke actineregulatoren celranduitsteeksels in verschillende contexten beïnvloeden.

In het experiment beschreven in figuur 2 werden vereeuwigde MEF's verguld op schotels met glazen bodem voorgecoat met fibronectine om integrine-gemedieerde signalering te activeren, geblokkeerd door gedenatureerd BSA, om vrije potentiële locaties voor celadhesie te blokkeren die niet afhankelijk is van integrine-activering. Om de logaritmische groeifase te bereiken bij 70%-80% samenvloeiing van cellen op de dag van het experiment, werden 0,7 x 106 MEF's 16 uur voor het experiment ...

Dit protocol heeft tot doel de dynamische parameters (uitsteeksels, retracties, ruches) van uitsteeksels aan de rand van zich verspreidende cellen te meten.

Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Van de celranduitsteekseltest is aangetoond dat deze direct correleert met celmigratie. Daarom kan het worden gebruikt als een voorlopige methode voor het identificeren van kritieke eiwitten en signaleringsmechanismen die betrokken zijn bij de beweeglijkheid van cellen. De methode is snel, eenvoudig, kosteneffectief en vereist geen fluorescerende etikettering of het gebruik van een dure fluorescerende microscoop.Michal Gendler, een student uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Voeg twee milliliter van een normale zoutzuuroplossing toe in het midden van een glazen bodemschaal en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was het gerecht drie keer met twee milliliter PBS.Verdun fibronectine met een concentratie van 10 microgram per milliliter in PBS en voeg 200 microliter van de verdunde oplossing toe aan de glazen middenschaal. Incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Bereid 1% BSA-oplossing en PBS voor en voer deze door een filter van 0,2 micrometer.Denatureer de oplossing door gedurende 30 minuten te broeden bij 70 graden Celsius in een voorverwarmd waterbad. Was de gecoate glazen bodemschaal drie keer met twee milliliter PBS. Voeg twee milliliter gedenatureerde BSA-oplossing toe en incubeer het gerecht gedurende een uur bij 37 graden Celsius.Was de glazen schaal drie keer met twee milliliter PBS. Vóór 16 tot 18 uur experiment met 0,7 miljoen cellen per weefselkweekplaat met een diameter van 10 centimeter om 70 tot 80% confluentie te bereiken. Voeg de volgende dag twee milliliter trypsine-oplossing toe aan de weefselkweekplaat en incubeer gedurende twee tot drie minuten totdat de cellen losraken.Voeg vijf milliliter van het medium toe om de trypsine te inactiveren. Tel met behulp van een hemacytometer de cellen en plaat 20.000 cellen in twee milliliter van het volledige medium in een onderste schaal. Incubeer vervolgens de schaal met vergulde cellen in een incubator gedurende 15 minuten.Schakel de verwarmingseenheid in en stel deze een uur voor de beeldvorming in op 37 graden Celsius. Schakel ook de kooldioxide-eenheid in en stel deze in op 5% 10 minuten voordat u de beeldvorming uitvoert. Schakel de microscoop en camera in.Schakel de computer in en open de microscoopacquisitiesoftware. Stel de vergroting in op een 40X droog lensfasecontrast. Stel de totale filmduur in op 10 minuten met een tijdsinterval van vijf seconden.Plaats na 15 minuten incubatie de glazen bodemschaal met aangehechte cellen in een adapter en bevestig deze. Plaats de adapter met de schotel in de sleuven in de microscooptrap. Haal het deksel van de schotel eraf, plaats het deksel van de kooldioxide en open de kooldioxideklep.Zoek een geschikte cel voor beeldvorming. Begin met filmacquisitie nadat je je op de cel hebt gericht. Om de beeldanalyse uit te voeren, selecteert u het rechte gereedschap in de beeldanalysesoftware en maakt u acht lijnen van 20 willekeurige eenheden loodrecht op de uitsteeksels in een radiale opstelling op elke 45 graden, inclusief lamellen en celrand.Ga in de hoofdwerkbalk naar afbeelding, selecteer Stapels en klik vervolgens op Reslice om een kymograafafbeelding te genereren die de beweging van afzonderlijke punten in het celmembraan beschrijft. Gebruik de kymograafafbeeldingen om het aantal uitsteeksels, retracties en ruches in elk van de acht gebieden in de cel gemarkeerd door de rasterlijnen te extraheren en handmatig te tellen. Deze getallen vertegenwoordigen de frequentie van uitsteeksels, terugtrekkingen en ruches per 10 minuten.Bepaal de uitsteeksel persistentie, afstand en snelheid door kymografie analyse. Om de uitsteekselafstand te bepalen, trekt u loodrechte lijn van de basis van het uitsteeksel naar de hoogste top van het uitsteeksel. Druk op M om de lengte van de lijn in pixels te meten en ervoor te zorgen dat de pixel-micrometerverhouding bekend is om de lengte in micrometers om te zetten.Kwantificering van uitsteeksels, reacties en ruches werd handmatig uitgevoerd per 10 minuten en de gemiddelde frequentie verkregen voor uitsteeksels en retracties was 5,1 en 2,1 voor ruches. De representatieve kymograaf had een uitsteekselafstand van ongeveer 4,8 micrometer en een uitsteekseltijd van ongeveer 0,6 minuten. Er wordt een voorbeeld weergegeven van een cel die van de analyse moet worden uitgesloten.Uit de kymografie-analyse bleek dat de cel niet aanwezig was in de verspreidingsfase en geen duidelijke membraanuitsteeksels vertoonde. Het belangrijkste is om de juiste cellen te kiezen voor beeldvorming. Een goede cel moet zich in de verspreidingsfase bevinden en mag andere cellen niet aanraken om cel-celcommunicatie en signalering te voorkomen.De methode kan worden gebruikt als een voorlopig hulpmiddel voor het testen van cytoskeletale dynamica waarbij celmotiliteit betrokken is voordat wordt besloten om meer resultaten uit te voeren die celmigratietests vereisen.

measuring-cell-edge-protrusion-dynamics-during-spreading-using-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Microscopische beeldvorming van levende endotheliale cellen die GFP-actine maakt karakterisering van dynamische veranderingen in het cytoskelet structuren. In tegenstelling tot technieken die vaste exemplaren te gebruiken, deze methode geeft een gedetailleerde evaluatie van de tijdelijke veranderingen in het actine cytoskelet in dezelfde cellen voor, tijdens en na de diverse fysieke, farmacologische of inflammatoire stimuli.

Studie van het actine cytoskelet in Live endotheliale cellen die GFP-actine

Er werd een nieuw beeldvormingsprotocol ontwikkeld met behulp van een op maat gemaakte motorgestuurde mechanische actuator om de meting van realtime-responsen op mechanische spanning in levende cellen mogelijk te maken. Relevant voor mechanobiologie, kan het systeem spanningen tot 20% toepassen terwijl het realtime beeldvorming met confocale of atomaire krachtmicroscopie mogelijk maakt.

Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

Wij presenteren een software oplossing voor semi-geautomatiseerde tracking van relatieve eiwitconcentratie langs de lengte van dynamische cellulaire uitsteeksels.

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Hier, detail we de experimentele technieken gebruikt om te evalueren van de uitsteeksel krachten die podosomes van toepassing op een compatibele film, vanaf de voorbereiding van de film naar de geautomatiseerde analyse van topografische beelden.

Uitsteeksel Force microscopie: Een methode om te kwantificeren krachten ontwikkeld door cel uitsteeksels

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Met behulp van een eerder ontworpen apparaat om mechanische belasting toe te passen op aanhangende cellen, dit document beschrijft een vernieuwde substratum geometrie en een aangepaste apparaat voor hoge-resolutie single-cell beeldvorming van gespannen cellen met een 100x olie onderdompeling doelstelling.

Hoge-resolutie beeldvorming van kern dynamiek in levende cellen onder Éénassige trekspanning

Deze methode is nuttig voor het kwantificeren van de vroege dynamiek van cellulaire adhesie en het verspreiden van verankerings afhankelijke cellen op het fibronectin. Bovendien kan deze test worden gebruikt om de effecten van veranderde redox homeostase op celspreiding en/of celadhesie-gerelateerde intracellulaire signalering trajecten te onderzoeken.

Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress

Live beeldvorming van lysosomale exocytose op micropatterned cellen maakt een ruimtelijke kwantificering van dit proces mogelijk. Morfologie normalisatie met behulp van micropatronen is een uitstekend hulpmiddel om algemene regels over de ruimtelijke verdeling van cellulaire processen te ontdekken.

Kraaktemporale parameters van cellulaire exocytose in micropatterned cellen kwantificeren

In dit protocol presenteren we de experimentele procedures van een celverspreidende test die is gebaseerd op live-cell microscopie. We bieden een open-source computationele tool voor de onbevooroordeede segmentatie van fluorescerend gelabelde cellen en kwantitatieve analyse van lamellipodiadynamiek tijdens celverspreiding.

Kwantitatieve analyse van celranddynamiek tijdens celspreiding

Dit artikel presenteert een gedetailleerd stapsgewijs protocol over het gebruik van een geïntegreerd multifunctioneel en door de gebruiker programmeerbaar systeem dat automatische meerkanaals beeldvorming en mechanobiologische analyse mogelijk maakt om de mechano-gevoeligheid van Ja-geassocieerd eiwit (YAP) op te helderen.

Volledig optische mechanobiologie ondervraging van ja-geassocieerd eiwit in menselijke kanker en normale cellen met behulp van een multifunctioneel systeem

Hier presenteren we een veelzijdig equibiaxiaal rekapparaat dat pneumatisch wordt bediend en compatibel is met microscopie met hoge resolutie.

Equibiaxiaal rekapparaat voor sterk vergrote live-cell confocale fluorescentiemicroscopie

Leer een celrand-uitsteekselassay om dynamische parameters van verspreidende cellen te meten met behulp van live-celmicroscopie en kymografie. Deze kosteneffectieve methode vereist geen fluorescentielabeling en helpt bij het identificeren van kritieke eiwitten en signaalmechanismen betrokken bij celmotiliteit.

Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie

Meer video's verkennen