Vereenvoudigde, high-throughput analyse van eencellige contractiliteit met behulp van microgepatterde elastomeren

Cel gegenereerde mechanische krachten zijn essentieel voor een goede werking in verschillende organen in het lichaam. Plus de darmen blaas, hart en anderen. Deze organen moeten stabiele patronen van celcontractie en ontspanning genereren om de interne hemostatische toestand te behouden.

Abnormale contractie van gladde spiercellen kan leiden tot het begin van verschillende aandoeningen, waaronder intestinale dysmotiliteit karakteriseren abnormale patronen van intestinale met spiercontractie, evenals aandoeningen zoals overactieve of onderactieve blaas. En in de luchtwegen kunnen sommige spiercellen die onregelmatige patronen samentrekken astmatische hyperresponsiviteit veroorzaken. Het is duidelijk dat contractiele mechanismen in cellen en weefsels kunnen leiden tot ziekten die behandelingsopties vereisen.

En aangezien deze aandoeningen rechtstreeks voortvloeien uit disfunctioneel contractiel gedrag van cellen, wordt het zowel logisch als noodzakelijk om de celcontractiele functie zelf te meten bij het screenen van potentiële kandidaat-geneesmiddelen. Naar aanleiding van recente ontwikkelingen in microtechnologie hebben we een gebruiksvriendelijke microplaatgebaseerde test ontwikkeld die kwantitatieve metingen van contractie van één cel mogelijk maakt. In honderdduizenden cellen genaamd flex, ook bekend als fluorescerend gelabelde elastomeer contracteerbare oppervlakken.

In deze benadering integreren we fluorescerende eiwitmicropatronen, en dus zachte films, die vervormen en krimpen wanneer cellen er tractiekrachten op uitoefenen. Belangrijk is dat de eiwitmicropatronen de celpositie, vorm en verspreidingsgebied beperken. De uniforme testomstandigheden en maken eenvoudige metingen mogelijk die alleen gebaseerd zijn op hun dimensionale veranderingen.

Over het algemeen maakt het platform, dat een browsergebaseerde beeldanalysemodule bevat, een eenvoudige analyse van contracteerbare celkracht mogelijk zonder delicate behandelingsprocedures of registratie van fiduciaire markers en kan het door elke onderzoeker worden bediend met de basiscelculturen en eenvoudige fluorescerende microscoop met lage vergroting. Deze technologie is ontworpen met de eindgebruiker in gedachten en heeft tot doel de toegangsdrempel voor elke laboratoriumwetenschapper te verminderen om cellulaire krachtbiologie te bestuderen Begin met het toevoegen van 20 milliliter media in een chronische buis, verkrijg een 24-well plaat ontworpen om celcontractiliteit te testen. Stel uw pipet in op 500 microliter en verkrijg een celzeef voor celpathogenen.

Verwijder het deksel op de 24-putplaat, houd de plaat zo omhoog en verwijder vervolgens voorzichtig de laag plastic bovenop de plaat. Zet de plaat voorzichtig terug neer. Zuig alleen de bovenste laag PBS uit elke put om morsen te voorkomen.

Verwijder nu, één rij per keer, de resterende PBS uit de put en vul snel met 500 microliter celmedia. Schud de plaat voorzichtig en tik op zijn kant om ervoor te zorgen dat de hele bodem van de put bedekt is met oplossing. Zodra alle putten zijn gevuld met media, zet u de plaat aan de zijkant.

Haal op dit punt uw celkweek uit de couveuse. We gaan een stevig associatieprotocol voeren. Doel van dit protocol is om een suspensie van 50.000 cellen per milliliter te creëren.

Voordat u de cellen zaait, moet u ervoor zorgen dat u uw cellen eenmaal door de zeef zeeft, om klonten cellen in afzonderlijke cellen op te breken, voorzichtig 500 microliter van uw celoplossing in elke put plaatst. Na het zaaien van de cel is het belangrijk om de platen een uur te laten zitten, zodat de cellen zich direct op de patronen kunnen nestelen. Nadat een uur is verstreken, plaatst u de plaat een nacht in een incubator.

Het tweede deel van het experiment bestaat uit het toevoegen van de medicijnen aan de 24-well plaat en fluorescerende beeldvorming van de plaat. Voor dit deel van het protocol hebben we twee belangrijke vereisten om de levensvatbaarheid en respons van robuuste cellen te garanderen. De eerste is dat de uiteindelijke concentratie DMSO in de putten met cel niet meer dan 1% is, wat betekent dat we een volledige verdunning van 100 uit onze medicijnvoorraden moeten maken.

De tweede is dat we DMSO niet zo direct aan de putten kunnen toevoegen, omdat het op de bodem van dat mengen zal crashen en vervolgens de cellen met een hoge concentratie zal beschadigen. In plaats daarvan moeten we een tussenoplossing van DMS0-medicijn en -media creëren, die we grondig kunnen mengen om hoge lokale DSSO-blootstelling aan de cellen te voorkomen. In dit protocol zullen we een zesstaps achtvoudige verdunning uitvoeren die een bereik bestrijkt van 40 micromolair tot één Nano-molair Maak de zesstaps achtvoudige verdunningsreeks door 30 microliter stockgeneesmiddeloplossing over te brengen in opeenvolgende 210 microliter volumes DMSO en grondig te mengen tussen elke overdrachtsstap In ons experiment, we zullen het effect van blebbistatine evalueren.

op menselijke blazen door de spiercellen. Om aan beide eisen te voldoen, zullen we eerst een intermediaire dmso- en mediaoplossing creëren. Dat levert een 16,7-voudige verdunning van DMSO op.

Vervolgens zullen we deze tussenoplossing aan onze cellen toevoegen, met behulp van verhoudingen die een extra zesvoudige verdunning opleveren, resulterend in een totale volledige verdunning van 100 en de uiteindelijke concentratie van 1% DMSO Om dit te bereiken, mengt u voor elke voorraadgeneesmiddeloplossing 30 microliter geneesmiddel in 470 microliter celkweekmedium en brengt u vervolgens 200 microliter van deze tussenoplossing over naar de juiste put op de 24-well plaat, die in elke put 1000 microliter bevat. Dit levert gezamenlijk een eindconcentratie van 1% DMSO Incubate op gedurende de juiste tijd. In ons experiment incuberen we gedurende 30 minuten, wanneer u klaar bent om een levende nucleaire vlek over uw putten toe te voegen, voegt u een verdunning van één tot 10.000 toe uit de voorraad.

Laat het nog eens 15 minuten incuberen. Wanneer u klaar bent om in beeld te komen, hebt u een fluorescerende microscoop nodig die is uitgerust om de fluorescerende kanalen voor zowel de gelabelde celkernen als de fluorescerende kleurstof in beeld te brengen. De micropatronen zijn gelabeld waarmee in ons voorbeeld het tri C-kanaal is.

Nu zullen we fluorescerend blebbistatinekernen afbeelden om afzonderlijke cellen te identificeren, zorg ervoor dat u de vlekcelkernen in exact dezelfde positie in beeld brengt als u het micropatroon bekijkt, zodat ze tijdens de analyse kunnen worden uitgelijnd. Upload de verkregen afbeeldingen naar uw computer en zorg ervoor dat de afbeeldingen correct zijn gelabeld, zodat de patroonkanalen eindigen op onderstrepingsteken PT. En beelden in het nucleaire kanaal eindigen in underscore dapi. Nu zullen we de tif-afbeeldingen converteren naar PNG-afbeeldingen, met behulp van afbeelding J Zodra afbeelding J is geopend, laadt u deze in één kanaal tegelijk.

We zullen eerst het patroonkanaal laden en het contrast aanpassen, om het signaal te maximaliseren en de achtergrond te minimaliseren. Daarnaast zullen we het beeld gladstrijken. Zodra de afbeelding naar wens is aangepast, wijzigen we het afbeeldingstype in acht bits.

Exporteer de afbeelding vervolgens als PNG-type. Schakel vervolgens het selectievakje in en gebruik segmentlabels als bestandsnamen. Maak een nieuwe map met de naam PNG's.

Sla vervolgens de PNG-bestanden daar op, Om de afbeeldingen te analyseren, navigeert u naar Biodock dot AI, maakt u een account aan en neemt u contact op met de auteurs om gratis toegang te krijgen tot de analysemodule. Log in zodra uw account is aangemaakt. Hier kunt u nieuwe afbeeldingen uploaden.

We zullen deze nieuwe batch, webexperimentgegevens JoVE noemen. Nu kunnen we de afbeeldingen importeren door ze te slepen en vervolgens neer te zetten, druk op OK.At dit punt en selecteer uw gegevens. Klik vervolgens op analyseren, scrol omlaag naar de module met het label contractiliteitsanalyse en druk vervolgens op selecteren.

Stel de vergroting in op dezelfde waarde die u hebt gebruikt voor beeldvorming Zodra de gegevens zijn voltooid, klikt u erop en kunnen we gegevens downloaden selecteren. Zodra de gegevens zijn gedownload, kunnen we vervolgens overlay-afbeeldingsparen zien voor elke ingevoerde afbeelding. We hebben ook toegang tot een samenvattende statistiek die ons de gemiddelde samentrekking voor elke set cellen geeft.

De maateenheid voor contractie is in pixels. Kijkend naar de gegevens kunnen we hier zien dat in de putten die alleen met DMSO werden behandeld, er een veel hogere samentrekking van cellen was in vergelijking met die cellen die werden behandeld met blebbistatine. We hebben ook toegang tot gegevens voor elk afzonderlijk patroon dat in een van de afbeeldingen is gedetecteerd.

Dit geeft ons gedetailleerde informatie over de locatie van de afbeelding, de oorsprong van het beeld, het positietype, het aantal cellen, nul één of meer dan één, de grootte van het micropatroon en de berekende contractie van de cellen. Deze lay-out bestaat uit elk geïdentificeerd patroon in de microplaat. Enkele celpatronen uit deze lijst waren gemiddeld om de gemiddelde contractie voor de PNG-afbeelding in het andere bestand te berekenen.

U kunt de gegevens met één cel sorteren en analyseren als dat nodig is voor uw experiment. Voor dit deel van de video zullen we representatieve gegevens weergeven die kunnen worden verzameld uit een 24-well plaat met die responsgegevens van blaas gladde spiercellen die zijn behandeld met twee verschillende geneesmiddelen. Dit zijn beelden van putten behandeld met respectievelijk DMSO en blebbistatine.

Hier kunnen we zien dat de cellen die alleen met DMSO zijn behandeld, een groot aantal contractmicropatronen vertonen, maar cellen die met blebbistatine zijn behandeld, waren groter en open om op te merken dat er minder contractie is. De gegevens in dit histogram tonen de variatie celcontractiliteit als gevolg van de verschillende behandelingen voor de cellen. Het distributiecentrum voor cellen behandeld met blebbistatine is lager dan het distributiecentrum voor cellen die werden behandeld met de DMSO.

Dit komt overeen met de informatie die in de vorige afbeeldingen wordt weergegeven. Omdat de cellen die met blebbistatine werden behandeld veel kleinere contractie vertoonden. Dit geeft aan dat behandeling met blebbistatine de cellen aanzienlijk ontspant.

Elk van deze gegevenssets draagt bij aan een punt op de dosisresponscurve dat kan worden verzameld uit een enkele 24-wellsplaat, volgens de protocollen die in de video worden getoond. Hier kunnen we zien dat cytochalasine D krachtiger is dan blebbistan, zoals blijkt uit de lagere contractiewaarden, gezien de hogere concentraties van het geneesmiddel. Als u uw experimenten aanzienlijk wilt schalen, is er een 384-putplaatversie beschikbaar, en deze kan worden gebruikt met automatisering om de experimenten drastisch te schalen.

Deze gegevens kunnen worden verzameld uit een 384-putplaat, in plaats van zes verdunningsstappen voor elk medicijn op de 24-putplaat, stelt de 384-putplaat ons in staat om 20 verdunningsstappen uit te voeren voor elk medicijn met meerdere replicaties. Sneeuwvlokken technologie is uniek. Het maakt visualisatie van eencellige contractie mogelijk met behulp van microscopie, wat tot nu toe onmogelijk was.

Technologie is dus afhankelijk van de vorm van statistieken die is gemodelleerd met fluorescerend gelabeld eiwit. Systematisch patroon is te vormen voor cellulaire contractie en maakt het mogelijk voor nauwkeurige meting van de modulatie van een contract van fenotype door een bepaald medicijn. Natuurlijk wordt deze technologie nog steeds actief ontwikkeld voor toepassingen en veel verschillende ziektegebieden, zoals astma, hart- en vaatziekten, ontstekingsimmuunoncologie en natuurlijk elk van onze ziekte-indicaties waarbij abnormale cellulaire contractie een sleutelrol speelt in de progressie van de ziekte.

Zoals we demonstreren, biedt deze op micropatronen gebaseerde technologie voor het meten van celcontractiliteit een vereenvoudigd alternatief voor traditionele tractiekrachtmicroscopie, die intuïtieve analyse biedt, het patroon ziet krimpen en een enkele celresolutie biedt in grote celpopulaties. Sommige overwegingen, deze methode kan uitdagingen opleveren voor het gebruik van cellen die ofwel te klein zijn, zoals T-cellen en neutrofielen, of celtypen die zich niet hechten. Bovendien zullen cellen die wekelijks binden, overwegend aan elkaar binden of die zich niet volledig verspreiden, geen meetbare contractiele signalen produceren.

Gebruikers van de technologie moeten zorgvuldig verschillende mogelijke celkweekmediumformuleringen evalueren voor hun specifieke celtype. omdat verschillende componenten, groeifactoren, serumspiegels en pH-gevoeligheden variabel gedrag kunnen veroorzaken. Optimalisatie van de protocollen moet doorgaan met het schalen van experimentele workflows.

Uiteindelijk als eencellige resolutie niet nodig is, of als het doelceltype een minimale spreidingscapaciteit heeft, kunnen traditionele aantrekkingskrachtmicroscopiemethoden worden gebruikt voor dergelijke experimenten. Anders hopen we dat deze tool een extra mogelijkheid biedt voor celbiologen om cellulaire contractie te bestuderen en hun studies uit te voeren.