Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

We presenteren een methode om door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide tumor antigeen-specifieke CD8 alpha beta single-positive T cellen te genereren met behulp van OP9-Delta-1 co-cultuur systeem. Deze methode is een krachtig hulpmiddel voor in vitro T celgeneratie en zal de ontwikkeling van in vitro-afgeleide T-cellen vergemakkelijken voor gebruik in regeneratieve geneeskunde en celgebaseerde therapieën. Het kan ook worden aangepast voor de generatie van andere lymfocyten, zoals NK cellen.

Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om de partij FBS en passage OP9-Delta-1 cellen consequent vooraf te evalueren wanneer cel-op-cel cytoplasma contact begint te celdifferentiatie en senescentie te voorkomen. Het aantonen van de procedure zal Dr.Meghan Good zijn, een chirurgische oncologie man van mijn team. Begin met het controleren van menselijke iPSC kolonies in een stereo-microscoop, en verwijder alle gebieden van differentiatie uit de cultuur met de plastic rand van een 200-microliter pipet tip.

Wanneer de kolonies 0,8 tot 1,2 millimeter in diameter bereiken, doorsnee de menselijke IPSCs. Aspirate de gebruikte media, en voeg 10 milliliter van menselijke iPSC media aangevuld met 10-micromolar ROCK remmer. Rol een wegwerpcel passaging tool over de gehele schotel in een richting, ervoor te zorgen dat uniforme druk te handhaven en dat het hele rolblad raakt de cultuur schotel.

Draai de kweekschaal 90 graden en herhaal het rollen. Visueel bevestigen de juiste snijden van de kolonies met een microscoop. Ze moeten gecheckt lijken.

Maak vervolgens de snijkolonies los door zachte mechanische spoeling met een pipet van 200 microliter. Visueel schatten van het aantal kolonie klontjes, en overdracht tussen 350 en 600 bosjes naar een nieuwe 10-centimeter schotel van de muis embryonale fibroblasten met 10 milliliter verse menselijke iPSC media aangevuld met ROCK remmer. Incubeer de schotel 's nachts op 37 graden Celsius.

De volgende dag, aspirate de gebruikte media, en voeg 10 milliliter verse menselijke iPSC media. Verander de media om de een of twee dagen, afhankelijk van de cel groeisnelheid. Kweek de OP9-Delta-1 cellen in OP9 media op 37 graden Celsius.

Wanneer ze samenvloeiing bereiken, de media aanzuigen en de cellen één keer wassen met vijf milliliter 1x magnesium, calcium en fenol roodvrije PBS. Aspirate de PBS, voeg twee milliliter van 05% trypsin-EDTA, en incubeer de cellen gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius. Voeg vervolgens vier milliliter OP9-media toe en distantieer de cellaag mechanisch door pipetten.

Breng de celsuspensie over naar een conische buis van 50 milliliter door een celzeef van 100 micrometer en vercentrifugeer vijf minuten lang bij 300 g bij vier graden Celsius. Aspirate de supernatant, en resuspend de cellen in 12 milliliter van OP9 media. Voeg acht milliliter OP9-media toe aan elk van de zes nieuwe celkweekschotels en plaat twee milliliter van de OP9-delta-1 celopsuspensie op elk gerecht.

Rock de schotel van links naar rechts en van voor naar achter om een gelijkmatige verdeling van de cellen te garanderen. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius, en herhaal passage wanneer de cellen samenvloeiing bereiken. Bereid gelatineiseerde OP9-Delta-1 gerechten een week voorafgaand aan co-cultuur met menselijke iPSCs.

Voeg vier milliliter van 0,1% gelatine toe aan drie nieuwe celkweekgerechten en broed ze gedurende 30 minuten uit bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, aspirate de gelatine, en voeg acht milliliter van OP9 media aan elk gerecht. Passage één confluent schotel van op9-Delta-1 cellen aan drie gelatine-gecoate schotels.

Na vier dagen, voeg 10 milliliter OP9 media aan elk gerecht van cellen, voor een totaal van 20 milliliter media per schotel. Begin de menselijke iPSC co-cultuur op OP9-Delta-1 confluent gerechten zeven tot acht dagen na het doorgeven van de cellen. Aspirate de media uit een confluent schotel van menselijke iPSCs, en voeg 10 milliliter van OP9 media.

Snijd en los celkolonies met behulp van een wegwerpcel passaging tool, en breng 350 tot 600 bosjes gesneden kolonies op een pre-gelatineiseerde OP9-Delta-1 schotel met 10 milliliter verse OP9 media. Rock de cultuur schotel van links naar rechts en van voor naar achter om te zorgen voor een gelijkmatige verdeling van kolonies. De volgende dag, aspirate de gebruikte media, en vervang het door 20 milliliter verse OP9 media.

De menselijke iPSC klonten co-gekweekt op OP9-Delta-1 voor een dag moet verschijnen als kleine, ronde, monolayer kolonies. Op dag vijf, aspirate 10 milliliter van gebruikte media, en voeg 10 milliliter verse OP9 media. De kolonies zullen beginnen te onderscheiden in primitieve mesoderm, die wordt gekenmerkt door een meerlaags donker centrum.

Herhaal dit proces op dag negen, waarna de meerlaagse centrumstructuren zullen evolueren naar koepelachtige vormen. Oogst de aamvadercellen op dag 13, waarna de structuren bestaan uit een donkere centrale organoïde omgeven door een netwerk van koepelachtige gebieden. Aspirate de media, en was de cellen een keer met vijf milliliter van 1x fenol rood-vrije Hanks'balanced zout oplossing met calcium en magnesium, of HBSS.

Voeg na de was 250 microliter van 5.000 eenheden per milliliter collagenase IV toe aan 10 milliliter HBSS. Voeg het mengsel aan de cellen, en incubeer ze op 37 graden Celsius gedurende 45 minuten. Aspirate de HBSS-collagenase mengsel, en was de cellen een keer met vijf milliliter PBS.

Voeg na het wassen met PBS vijf milliliter van 0,25% trypsine-EDTA toe en broed de cellen gedurende 20 minuten uit op 37 graden Celsius. Voeg vervolgens vier milliliter OP9-media toe en distantieer de cellaag door pipetting om een eencellige suspensie te maken. Breng de celsuspensie over op een conische buis van 50 milliliter door een zeef van 100 micrometer en versteen de buis vijf minuten lang met 300 g en vier graden Celsius.

Aspirate de supernatant, en resuspend de cellen in 10 milliliter van OP9 media. Plaats de celsuspensie op een nieuwe gelatineiseerde 10-centimeter celcultuur schotel, en uitbroed ze op 37 graden Celsius gedurende 45 minuten. Verzamel vervolgens niet-aanhangende cellen door zachte pipetting.

Breng de celsuspensie over naar een conische buis van 50 milliliter via een zeef en centrifuge zoals eerder beschreven. Dan, aspirate de supernatant, en resuspend de cellen in 10 milliliter van differentiatie media. Plaats de celopsuspensie op een nieuwe OP9-Delta-1 confluent schotel.

Doorsnee de cellen op dag 16 volgens de aanwijzingen van het manuscript, en blijf de niet-aanhangende cellen daarna om de vijf tot zeven dagen doorgeven. Na 35 dagen van differentiatie, verrijken de CD4-positieve celpopulatie door CD4 magnetische kraal isolatie volgens het protocol van de fabrikant. Dan, resuspend de cellen in OP9 media, en plaat een milliliter van cel suspensie in elke put van een weefsel-cultuur, platte bodem, 24-put plaat van confluent OP9-Delta-1.

Stimuleer cellen door 100 internationale eenheden van menselijke IL-2, vijf nanogram menselijke IL-7, 500 nanogram anti-menselijke CD3 antilichaam, en twee microgram anti-menselijke CD28 antilichaam aan elke put toe te voegen. Na vier tot zeven dagen kunnen cellen worden verzameld voor verdere analyse. Na cultuur op niet-gelatiniseerde OP9-Delta-1 in aanwezigheid van menselijke stamcelfactor, menselijke FLT3-ligand, en menselijke interleukine-7, hematopoietische voorlopers onderscheiden in CD3, CD7, CD4, en CD8 dubbel-positieve T-lijncellen, waarvan de meerderheid uitgedrukt T-cel receptoren specifiek voor de MART1 epiopolie.

Toen de CD4, CD8 dubbel-positieve T-cellen werden gestimuleerd met anti-menselijke CD3 en CD28 antilichamen in aanwezigheid van menselijke interleukine-7 en 2, het aantal CD3-positieve CD8 alpha beta single-positive cellen toegenomen en bleef specifiek voor de MART1 epitope, bevestiging van het behoud van hun geërfde antigeen specificiteit. Een ELISpot test bleek dat wanneer gekweekt in de aanwezigheid van MART1 peptide, menselijke iPSC-afgeleide CD8 alpha beta single-positieve T cellen scheiden hogere hoeveelheden interferon gamma in vergelijking met zowel bulk en CD8 alpha alpha single-positieve T-cellen. Er werd geen interferon gamma-expressie gedetecteerd voor T-cellen en antigeen-presenterende cellen alleen, waaruit blijkt dat menselijke T-iPSC-afgeleide T-cellen antigeen-specifiek en functioneel zijn.

Een belangrijke stap in deze methode is CD4 magnetische kraalverrijking om CD4-negatieve, CD8-negatieve dubbel-negatieve cellen te elimineren, die direct doden van dubbel-positieve cellen bij stimulatie kunnen veroorzaken. Deze techniek is toepasbaar voor gebruik met verschillende bronnen van menselijke cellen, waaronder hematopoietische stamcellen en embryonale stamcellen. iPSC-afgeleide onrijpe T-cellen gegenereerd door deze methode kunnen verder worden verbeterd voor de generatie van volwassen menselijke tumor antigeen-specifieke naïef-achtige T-cellen voor toekomstig therapeutisch gebruik.

Na het bekijken van deze video, moet de kijker begrijpen hoe de menselijke iPSC-afgeleide CD8 alpha beta single-positive T cellen genereren met behulp van de OP9-Delta-1 co-cultuur systeem.