Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Kwantitatieve multiplexed co-immunoprecipitatie, of QMI, stelt gebruikers in staat om tegelijkertijd honderden binaire interacties te meten in een vooraf gedefinieerd eiwitinteractienetwerk. Door meerdere co-IP's tegelijk in hetzelfde lysaat uit te voeren, kunnen bioinformaticatechnieken vervolgens op gecoördineerde wijze onderzoeken hoe groepen co-associaties veranderen. De test is tijdrovend om te ontwikkelen, maar zodra het QMI-paneel in de hand netwerk schaal gegevens kunnen worden verzameld over signaal transductie systemen in een relatief eenvoudig 's nachts test.

QMI vereist de nauwkeurige pipetting van verschillende monsters en reagentia in 96 putplaten. Bij het instellen en uitvoeren van elke test moeten zorgvuldige opmerkingen worden gemaakt om fouten te voorkomen. Voor monsterbereiding en immunoprecipitatie begint u met het lyseren van het monster in een geschikt wasmiddel met protease- en fosforremmers voor een incubatie van 15 minuten op ijs.

Draai aan het einde van de incubatie het monster naar beneden om de membranen en het puin te verwijderen en voer een BCA-test uit op de supernatant om de eiwitconcentratie volgens standaardprotocollen te bepalen. Na het normaliseren van de eiwitconcentraties, bereid een magnetische kraal master mix die ongeveer 250 magnetische kralen van elke klasse per put bevat. Gebruik magnetische scheiding om het magnetische kraalmengsel twee keer te wassen in fly p-buffer voordat u de kralen opnieuw in 20 microliters van fly p-buffer per monster insus.

Na een grondige pipetting, aliquot 20 microliter van kralen in een ijskoude microcentrifuge buis per monster en voeg gelijke volumes van lysaat met genormaliseerde eiwitconcentraties aan elke buis voor immunoprecipitatie. Verdeel vervolgens elk lysaatmonster in één buis voor elke plaat die wordt uitgevoerd en immunoprecipitaat de monsters op een rotator bij vier graden Celsius 's nachts beschermd tegen licht. De volgende ochtend gebruik maken van een magnetische kraal rek om het lysaat te verwijderen uit de eerste set van buizen en was de kralen twee keer in 500 microliters van ijskoude Fly P buffer per wasbeurt.

Na het berekenen van het resuspensievolume worden de immunoprecipitaten opnieuw opgetrokken in het berekende volume van de ijskoude Fly P-buffer. Grondig resuspend de magnetische kralen door zachte pipetting en distribueren 25 microliter kralen per goed over een platte bodem 96 put plaat op ijs. In een andere 96 putplaat, verdunnen door attiniated sonde antilichamen aan een twee keer werkende concentratie.

Gebruik een multichannel pipet om 25 microliter van elke sonde antilichaamverdunning te verdelen in de juiste putten van de magnetische kraal met testplaat en schud met hoge snelheid op een horizontale plaatshaker om de magnetische kralen te mengen en opnieuw te verbouwen. Na het mengen, de snelheid te verlagen voor een uur incubatie op vier graden Celsius beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie was je de plaat drie keer met verse Fly P buffer per wasbeurt op een magnetische plaatwasser op vier graden Celsius.

Na de laatste wasbeurt, resuspend de kralen in 50 microliters van streptavidin PE verdund een tot 200 in Fly P buffer. Schud de mix en resuspend de kralen voor het uitbroeden van de plaat op vier graden Celsius gedurende 30 minuten beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de plaat drie keer met Fly P buffer op een magnetische plaat wasmachine op vier graden Celsius en resuspend de kralen in 125 microliters van Fly P buffer.

Schud de plaat gedurende een minuut bij 900 rotaties om de kralen grondig te resuspend en laad de plaat in een refridgerated flow cytometer. Selecteer in de flow cytometersoftware de instelling High RP1 Target, een stopvoorwaarde van 1.000 kralen per regio en een monstervolume van 80 microliters. Pauzeer de run halverwege en resuspend de kralen om te voorkomen dat de afwikkeling.

Exporteer aan het einde van de run de gegevensbestanden in de XML-indeling. Als u ANC-analyses wilt uitvoeren, vult u het ANC-invoerbestand in om de details van het experimentele ontwerp weer te geven en voert u het programma uit, waarmee een CSV-bestand in de active directory wordt geschreven. Het bestand eindigt in hits.

csv zal de eiwitco-associaties rapporteren die aanzienlijk verschillen op een vals-positief niveau van 0,05 tussen de controle en experimentele omstandigheden in ten minste drie van de vier experimentele replicaties. Plak de kolomtitels van de uitvoer van het gegevensbestand door Matlab die eindigt in mfi voor gewogen correlatienetwerkanalyse. csv in de eerste kolom van een nieuwe spreadsheet en voeg de kolommen Experiment voor experimentnummer en Behandeling voor experimentele behandeling en andere variabelen toe die moeten worden geanalyseerd.

Sla dit bestand op als eigenschappen. csv en open R Studio. Stel de werkmap in op een map met de mfi.

csv en eigenschappen. csv-bestanden, markeringssecties van code en druk op Opdracht enter om de R-opdrachten uit te voeren zoals aangegeven in het opdrachtbestand met commentaar. De gewogen correlatie netwerk analyse modules aanzienlijk gecorreleerd met elke experimentele eigenschap zal worden uitgevoerd als een grafisch bestand en de correlatie van elke interactie met elke module zal worden uitgevoerd als een CSV-bestand.

Voor elke interactie in het ANC-uitvoerbestand moet u bepalen of die interactie ook significant is voor CNA en een nieuwe kolom maken die aangeeft of elke ANC-hit ook een CNA-hit is. Converteer de waarden om tweevoudige wijziging te registreren en bereken de gemiddelde waarde voor alle ANC union CNA-treffers. Tot slot, maak een nieuwe spreadsheet met elke ANC unie CNA hit vermeld door de immunoprecipitatie doel in een kolom, de sonde doel in de tweede kolom, en de vouw verandering waarde in de derde kolom.

Importeer dit bestand in Cytoscape als een netwerk om een knooppuntranddiagram te maken. Eiwitinteracties met een hoog vertrouwen die door de twee onafhankelijke statistische benaderingen worden geïdentificeerd, worden gevisualiseerd als node-randdiagrammen met behulp van de open source-software Cytoscape of als heatmaps met behulp van de R-code en analyse-instructies die in het aanvullende materiaal zijn opgenomen. Gedurende het protocol, gebruikers moeten ervoor zorgen om pipet nauwkeurig, om nauwgezette records te houden, en om de monsters koud te houden te allen tijde.

We hebben QMI gebruikt om te begrijpen hoe signaaltransductietrajecten onderscheid maken tussen verschillende invoertypen en informatie uit meerdere receptoren integreren.