Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

Binnen meercellige organismen, weefsel toont hoge graden verder in hun ruimtelijke oriëntatie. Cellen uitlijnen en tonen een bereik van prioriteit over grote afstanden in de loop van morfogenese. Om te begrijpen hoe de vlakke regelingen van epithelia wordt bereikt tijdens de ontwikkeling, is het cruciaal om de oriëntaties en groeidynamiek van de cel te volgen met een hoge ruimtelijke temporele getrouwheid in vivo.

Het beschreven protocol is ontworpen om celgedrag op globaal en lokaal niveau in de drosophila popdermis te beeld en analyseren. Deze methodologie kan inzicht geven in verschillende theorie van onderzoek, celbiologie, morfogenese en vlakke polariteit en kan worden toegepast op de analyse van andere weefsels, structuren en modellen. Alle stappen kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd na enige oefening.

Ze eisen precisie. Visualisatie van dit protocol helpt bij het bereiken van optimale resultaten in een kortere tijd. De verpoppende dissectie is complex.

Om te beginnen, gebruik een bevochtigde kwast om geënsceneerde witte pre-pop over te brengen naar een verse plastic flacon, en houd ze daar zo lang als nodig is bij 25 graden Celsius. Verwijder vervolgens elke pop van de wand van de flacon met behulp van tangen. Lijm de ventrale kant van elke pop op een glazen schuif bedekt met dubbelzijdige plakband.

Tik voorzichtig op de hoofdspracles en het dorsale oppervlak van de pop met de uiteinden van de tangen om de hechting van de popgeval aan de tape te verzekeren. Begin dissectie onder een stereomicroscoop door het operculum voorzichtig uit het puparium te verwijderen met de tangen. Steek een puntje van de tangen in een ondiepe tussen de pop geval en de pop oppervlak door de opercular opening.

Scheur de zaak van kop tot staart lateraal in een of meer schommels, het vermijden van knijpen de pop. Vouw de gebarsten popgeval terug aan de zijkanten terwijl je doorgaat naar het achterste uiteinde. Verwijder de pop uit de geopende pop geval door het voorzichtig invoegen van de tangen onder het dier en voorzichtig omhoog te trekken.

De pop kleeft aan het puntje van de tangen. Houd de pop voorzichtig aan de ventrale kant, en breng de pop naar een glazen bodem schotel op de top van een kleine druppel gasdoorlatende halocarbon olie. Rol een stuk nat tissuepapier aan de randen van de schotel en bedek de schotel om de luchtvochtigheid te behouden.

Oriënteer de pop over de oliedruppel op de glazen bodemschotels volgens het domein en het te evalueren proces. Voor lange termijn live beeldvorming van de vroege uitbreiding van de rugnesten, dorsale lateraal oriënteren van de pop. Om hun late expansie en weefsel remodelleren beeld, dorsaal oriënteren van de pop.

Breng de glazen bodem schotel met de gemonteerde pop naar de microscoop stadium en focus op het oppervlak van de buikstreek met behulp van overgedragen licht. Om mitotische recombinatie in te zetten om genetische mozaïeken in het buikeptheel te induceren, bereiden maagdelijke vrouwtjes met een hitteshock induceerbare flipase, een FRT-locatie op een specifieke genomische locatie en een herkenbare cellulaire marker distaal naar de FRT-site. Bereid mutante mannetjes voor die een FRT-locatie dragen op de gelijkwaardige genomische locatie.

Kruis verschillende vrouwtjes en mannetjes in een drie tot een verhouding in een plastic flacon op 25 graden Celsius voor vier tot vijf dagen. Om somatische klonen in de histoblasten te genereren, voert u een hitteschokbehandeling uit in het derde instar larvestadium van het nageslacht van het kruis door de plastic flacons met de dieren in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende 45 minuten tot een uur onder te dompelen. Gebruik in de image J-software de maximale intensiteitsprojectiefunctie om de Z-stacksegmenten te beschermen die zijn verworven door confocale microscopie in 2D.

De nesten hebben een karakteristieke vorm die ze oriënteert in een vlakke coördinatensysteem voorste naar links en dorsale naar de top. Om met deze analyse optimale resultaten te bereiken, moet het invoerbeeld met hoge resolutie worden verkregen. Als u kwalitatieve oriëntatiewaarden wilt verkrijgen op lokale celranden, klikt u op het insteekmenu en kiest u de verdelingsoptie oriëntatie J.

Stel de Gaussische venster sigma in op één pixel, kubieke spline op verloop, minimale samenhang op 20 procent en minimale energie op één procent. Gebruik de optie kleuronderzoek van de plug-in. Stel tint in op oriëntatie, verzadiging op samenhang en helderheid op invoerafbeelding.

Deze kleur codeert celrandoriëntaties ten opzichte van het ingestelde vlakke coördinatensysteem. Gebruik vervolgens onder het insteekmenu de optie Oriëntatie J-maat om cellulaire oriëntaties en richtingscel te kwantificeren tot celuitlijning. Genereer kleine, aangrenzende niet-overlappende gebieden van belang van uniform gewicht ongeveer 20 micrometer keer 20 micrometer binnen het gebied bezet door de histoblasten.

Met een persmaatregel wordt de dominante lokale oriëntatie en samenhang van de ROI's berekend. In deze studie, de gebruikte methode is in staat om hoge resolutie films van de ontwikkelende pop te genereren voor perioden van maximaal 48 uur zonder significante foto bleken of foto toxiciteit. Voorbeelden van wild type klonen gekenmerkt door de afwezigheid van RFP NLS en hun dubbele plekken op 26 uur na puparium vorming worden hier getoond.

De klonen langwerpig langs de segmentale grenzen. Dubbele klonen gerangschikt in parallel of in tandem. Morfologie van een wild type kloon op 26 uur en 47 uur na puparium vorming toont complexe randmorfologie in beide stadia.

Box en snorharen percelen voor geometrische parameters op 26 uur en 47 uur na puparium vorming tonen de gemiddelde gebied en omtrek aanzienlijk toegenomen in dit tijdvenster. De oriëntatie van de kloon werd gehandhaafd tijdens uitbreiding en remodellering. Vormparameters op 26 uur en 47 uur na de vorming van puparium geven aan dat de ruwheid, rondheid en circulariteit nauwelijks veranderd zijn in de wildtypeklonen.

Zorg ervoor dat u de pop niet beschadigt, anders zal het binnen een paar uur sterven, wat de live beeldvorming beïnvloedt. Dit protocol vereist niet dat een sartus reagens of instrument wordt gebruikt. Vermijd knijpen jezelf bij het ontleden.

Door het toepassen van deze methoden mogelijk om hoge resolutie films te genereren voor lange termijn periodes met behulp van verschillende imagine technieken. Brandpunt aan foton of spinnende schijven. Chlorale analyse kan worden gebruikt om niet-autonome reacties te onderzoeken, omdat willekeurige cellen vergemakkelijken bij de identificatie van kruisgesprekken of celcommunicatiemechanismen.

Deze methoden kunnen gemakkelijk worden aangepast om een volledig scala van morfogenetische verschijnselen te bestuderen, met inbegrip van de coördinatie van epidermale, gespierde en neuro-ontwikkeling tijdens metamorfose.