Gelijktijdige stroming cytometrische karakterisering van meerdere celtypen opgehaald uit muis hersenen/ruggenmerg via verschillende homogenisatie methoden

De ontwikkeling van selectieve gen- en drugleveringsinstrumenten voor de behandeling van de neurodegeneratieve aandoeningen vereist de kwantificering en karakterisering van celtargeting, bij herbe toediening, of virale vectoren, of nanodeeltjes. Ze hebben doorvoer en multiplexing mogelijkheden van flow cytometrie, maakt de eenvoudige en gelijktijdige identificatie van meerdere celtypes uit de muis hersenen en het ruggenmerg. Het demonstreren van de procedure zal Francisco Javier Molina Estevez, een post-doc van Alexander's Laboratory.

Na het oogsten van de hersenen en het ruggenmerg van een acht weken oude C57 Black 6 muis, plaats de weefsels in individuele putten van een zes-put plaat, met twee milliliter ijskoude HPSS per goed op ijs. Verdeel elk geoogst weefsel in twee gelijke stukken. En gebruik een schaar om de helft van elk weefselmonster in één tot twee millimeter dikke stukken te hakken.

Wanneer alle weefsels zijn gefragmenteerd, pre-spoel een gemodificeerde 1,000 microliter pipet tip in HPSS, en gebruik de pipet om elke weefsel suspensie over te brengen in individuele 15 milliliter conische buizen. Spoel de putten af met nog eens twee milliliter HPSS per put. En trek de wasbeurten in de overeenkomstige 15 milliliter conische buizen.

Sediment de monsters door centrifugatie. En meng 50 microliter enzym P uit een neurale weefseldissociatiekit met 1.900 microliter Buffer X uit de kit per monster. Verwarm het enzymmengsel minstens 10 minuten bij 37 graden Celsius.

En de supernatant van elke weefselopvangbuis aanzuigen. Wanneer het enzymmengsel klaar is, voegt u 1,95 milliliter van de oplossing toe aan elk monster. En voorzichtig vortex om de pellets opnieuw op te schorten.

Vervolgens, incubeer de monsters op een wiel gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius, en meng 10 microliter van Enzym A met 20 microliters van Buffer Y per monster. Verwarm de tweede enzymoplossing voor op 37 graden Celsius, voordat u 30 microliter van de oplossing toevoegt aan elke weefseloplossing aan het einde van de schudden incubatie. Gebruik een 1.000 microliter pipettip, voorgespoeld met HPSS om elk monster voorzichtig te mengen.

En breng de exemplaren 15 minuten terug aan het stuur bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, arresteer de enzymatische reacties met 10 milliliter ijskoude HPSS. En sediment de monsters door centrifugatie.

Aan het einde van de centrifugatie, opnieuw opschorten van de pellets in zeven milliliter van ijskoude HPSS per buis. En voorzichtig vortex elk monster, alvorens de buizen op ijs. Voor weefselhomogenisatie, voeg drie milliliter voorgekoelde HPSS aan de voorgekoelde glasmortel van een dounce weefselmolen, en breng de tweede helft van een van de geoogste hersenen of ruggenmergweefsel monsters naar de mortel.

Macerate het weefsel voorzichtig met 10 slagen van Stamper A, gevolgd door 10 slagen van Pestle B.En breng het gehomogeniseerde mengsel over in een nieuwe 15 milliliter conische buis. Vul de buis tot een eindvolume van 10 milliliter met voorgekoelde HPSS voor centrifugatie. En bretel de pellet opnieuw in zeven milliliter verse HPSS met vortexing, voordat het monster op ijs wordt gehouden.

Voor het verwijderen van puin, voeg drie milliliter van voorgekoelde isotone Percoll oplossing aan elk verteerd of gehomogeniseerd monster. En voorzichtig vortex de monsters om ervoor te zorgen dat ze homogeen gemengd. Vervolgens centrifugeren de monsters, en voorzichtig verwijderen van de witachtige schijf van puin en myeline drijvend op het oppervlak van de oplossing.

Wanneer het puin is weggegooid, verzamelen alle, maar de laatste 100 microliter van de supernatant van elke buis zonder verstoring van de pellets. Schors elke pellet opnieuw in één milliliter FACS BL-oplossing voor overdracht in afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. Na deze integratie met de Percoll-oplossing is het belangrijk om de puinschijf en de supernatant zeer zorgvuldig te verwijderen zonder de celpellet los te maken om monsterverlies te voorkomen.

Na centrifugatie, zorgvuldig aspirate de supernatant van elke buis, en opnieuw opschorten de pellets in 350 microliters van verse FACS BL per buis. Voor de stromingscytometrische analyse van de geïsoleerde celtypen, de monsters met vijf microgram per milliliter FC-blok per buis gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius uitbroeden alvorens het juiste antilichaam aan elke buis toe te voegen volgens het permanente protocol in de tabel. Vortex elke buis gedurende vijf seconden te mengen.

En plaats de monsters op vier graden Celsius gedurende 15 minuten beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de monsters met een milliliter PBS per buis, en centrifuge. Schort de pellets opnieuw op in het juiste volume streptavidin per buis.

Na vortexing te mengen, incubeer de monsters gedurende 10 minuten op vier graden celsius beschermd tegen licht. En was de cellen met een milliliter PBS per buis zoals aangetoond. Na het weggooien van de supernatants, opnieuw opschorten de pellets in 300 microliter verse FACS BL per buis.

En label elk monster met vijf microliters van 7-AAD. Bewaar vervolgens de monsters op vier graden celsius beschermd tegen licht tot cytofluorometrische analyse. De homogenisatie methode produceert een hogere cel opbrengst van zowel de hersenen en het ruggenmerg in het algemeen, maar de meerderheid van de cellen opgehaald zijn meestal dood, wat resulteert in slechts en een ongeveer 14%genezen van levensvatbare cellen uit de hersenen, en een ongeveer 10% genezen van het ruggenmerg.

In tegenstelling, de papaïne spijsvertering methode resulteert in een algehele betere behoud van cellulaire levensvatbaarheid. Analyse van de hersenen en ruggenmergcel suspensies met een negen kleur bi-flow cytometrie, onthult de aanwezigheid van CD45 +CD11b + microglia, en macrofagen. En CD45+CD11b-lymfocyten in beide weefsels.

De CD45-cel populaties kunnen dan worden gediscrimineerd op basis van hun positiviteit voor astrocyten, of oligodendrocyte markers, of ferional en endotheel oppervlak marker expressie. Met behulp van de homogenisatiemethode is tussen 32 en 38% van de levensvatbare cellen van hematopoietische oorsprong. Terwijl de enzymatische spijsverteringsmethode resulteert in de verwerving van een zeer grote fractie van een niet-hematopoietische CD45-cellen.

Opmerkelijk is dat CD45+CD11b+microglia en macrofagen de meest voorkomende levensvatbare celfractie met de homogenisatiemethode vertegenwoordigen. De spijsverteringsmethode produceert echter een meer heterogene weergave van celtypen, waaronder astrocyten, oligodendrocyten, endotheelcellen en neuronen. Dit protocol is veelzijdig en kan worden gebruikt voor verschillende downstreamtoepassingen, zoals de kwantificering of isolatie van specifieke cellen subpopulaties, primaire cultuur of biochemische of RNA-sequencing-analyse.

We hebben dit protocol geïmplementeerd om de genexpressie en functionele handtekeningen van verschillende CNS-populaties te beoordelen tijdens deze progressie, of na behandeling in een muismodel van endotrofische laterale sclerose.