In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen

Het vrijkomen van extracellulaire vallen door neutrofielen en andere immuuncellen is belangrijk in aangeboren immuniteit, maar ook sterk verbonden met ontstekingspathologieën. Er is zeer weinig bekend over dit proces in macrofagen, hoewel deze cellen een cruciale rol spelen bij ontstekingsrespons. Dit protocol biedt een primaire menselijke in vitro model van macrofagen extracellulaire val of mast release.

Het biedt ons een model om een potentiële fysiologische groei van deze structuur in vivo te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de cellen uit dit protocol zijn primaire cellen geïsoleerd van menselijke buffy vacht preparaten. Er is geen priming stap nodig om de monocyet te onderscheiden in macrofagen, wat in contrast staat met andere monocytencellijn zoals THP-1 cellijn.

Dit protocol is gemakkelijk aan te passen aan andere immuuncellen, waaronder geïsoleerde neutrofiele en microglia. Extracellulaire val geproduceerd door macrofagen zijn zeer kwetsbaar, dus zorgen moeten worden genomen tussen stap om de integriteit van de gekleurde vallen te behouden. Onder steriele omstandigheden, bereid M1 priming medium door toe te voegen aan de volledige RPMI-1640 cultuur media, interferon gamma aan de concentratie van 20 nanogram per milliliter en lipopolysaccharide aan de concentratie van een microgram per milliliter.

Bereid M2 priming media door interleukine 4 toe te voegen aan de volledige RPMI-1640 cultuurmedia aan de concentratie van 20 nanogram per milliliter. Onder steriele omstandigheden, aspirate media uit de gezaaide en gekweekte weefsel kweekplaat putten met HMDM. Voeg voorzichtig in elke put, een milliliter steriele PBS voorverwarmd tot 37 graden Celsius.

Verwijder de PBS-buffer en was twee keer extra. Voeg een milliliter van de M1 of M2 priming media aan elke put met de HMDM. Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius in aanwezigheid van 5%kooldioxide in een cel incubator.

Bereid onder steriele omstandigheden de kweekmedia met verschillende stimulatoren van de MET-release voor op de volledige RPMI-1640-media. Voor experimenten met hypochlorous zuur stimulatie, bereid 200 micromolar hypochlorous zuur in een Falcon buis met HBSS die is voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Na de polarisatiebehandeling, aspirate de cel media van elke put en zorgvuldig wassen van de cellen drie keer met een milliliter aliquots van ofwel steriele PBS voor PMA, TNF alpha, en interleukine 8 stimulatie of HBSS voor hypochlooeuze zuur stimulatie.

Na het verwijderen van de PBS in de laatste wasstap, voeg een milliliter van complete media met PMA, TNF alpha, of interleukine 8. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide in een cel incubator gedurende zes uur voor TNF alpha stimulatie en 24 uur voor PMA of interleukine 8 stimulatie. Voor experimenten met hypochloorzuur, na het verwijderen van de HBSS in de laatste wasstap, voeg een milliliter vers bereide hypochlorous zuur.

Vervolgens incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius in aanwezigheid van 5%kooldioxide in een cel incubator. Daarna, zorgvuldig aspirate de cellen'supernatant en was de cellen drie keer met een milliliter aliquots van HBSS. Na het verwijderen van de HBSS uit de laatste wasstap, voeg een milliliter van complete RPMI-1640 cultuur media.

Vervolgens broeden de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in de aanwezigheid van 5%kooldioxide in een cel incubator. Bereid SYTOX groene kleurstof in HBSS met een concentratie van 40 micromolar. Voeg direct 25 microliter van de kleurstof toe aan elke put die HMDM bevat.

Incubeercellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten in het donker. Plaats vervolgens de HMDM in weefselcultuurputten op het microscoopstadium van een omgekeerde fluorescerende microscoop voor beeldvorming. Schakel een breedspectrum fluorescerende lichtbron, heldere lichtbron en omgekeerde microscoop in die zijn geïnstalleerd met een kleurendigcamera met hoge resolutie.

Draai het filterwiel naar de nummer twee positie voor groene fluorescentie met excitatie op 504 nanometer en afmeting op 523 nanometer. Met behulp van de 5X doelstelling, focus het beeld met de grove focus dan de fijne focus knoppen op de microscoop totdat het beeld lijkt scherp, duidelijk en gericht. Schakel de microscoop over naar de cameramodus.

Start de bijbehorende software. Klik op de knop Afspelen om een voorbeeld van de afbeelding te bekijken en de fijne focusknop op de microscoop aan te passen totdat de afbeelding scherp, helder en gefocust wordt weergegeven in het voorbeeldvenster van de software. Klik op de knop Vastleggen.

Klik in de software op Bestand. Opslaan als het vereiste afbeeldingsbestandstype. Draai op de microscoop het filterwiel naar de positie nummer vijf voor beeldvorming op helder veld en herhaal de opnameprocedures om het bijbehorende beeld van helder veld te verkrijgen.

Heldere veldbeelden die de morfologische veranderingen van HMDM in reactie op stimuli tonen worden hier getoond. M1-gepolariseerde macrofagen van experimenten met HMDM blootgesteld aan interferon gamma en lipopolysaccharide toonde een langwerpige en spindel-achtige celvorm. Ter vergelijking, de morfologie van de M2-gepolariseerde macrofagen na blootstelling van HMDM aan interleukine 4 gedurende 48 uur waren meestal rond en plat.

Het vermogen van gedifferentieerde HMDM-fenotypes om MET's vrij te geven werd gevisualiseerd door live-cel fluorescentiebeeldvorming met SYTOX groen. De controle verkregen uit elk HMDM-fenotype dat gedurende 24 uur werd geïncubeerd bij afwezigheid van pro-inflammatoire stimuli toonde zeer beperkte groene kleuring. Positieve kleuring voor MET's, weergegeven als groene strepen, werd bereikt met blootstelling van M1-HMDMs aan hypochloorzuur, PMA, interleukine 8 of TNF alpha.

De aanwezigheid van een aantal groene vlekken zichtbaar in de cellen weerspiegelt verlies van membraan integriteit die kan voortvloeien uit celdood die onafhankelijk is van extracellulaire val release. De experimenten uitgevoerd met M2-HMDMs blootgesteld aan interleukine 4 toonde geen afgifte van DNA uit de cellen, zoals aangegeven door de afwezigheid van de strengen of strepen van extracellulaire DNA. Echter, er was een cellulaire opname van groene fluorescerende kleurstof met het hypochloorzuur en TNF alpha.

Het is belangrijk om te voorkomen dat de directe heldere licht die de kleuring kan overbelichten voordat beeldvorming. Extracellulair DNA kan worden gekwantificeerd door qPCR-analyse op nucleair en mitochondriaal DNA aanwezig in celsupernatant. Verdere karakterisering van de maststructuur en de rol ervan in chronische ontstekingen met behulp van HMDM kan meer klinisch relevant zijn in vergelijking met andere vereeuwigde cellijn macrofagen winkels.