Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

Membraan en celwand selectieve fluorescerende kleurstoffen zijn belangrijke instrumenten voor de analyse van organelle dynamiek en levende schimmelcellen. Onze protocollen bieden essentiële theoretische achtergrond en praktische richtlijnen voor de toepassing van een selectie van deze kleurstoffen als echt vitale vlekken. Het belangrijkste punt hiervoor is het gebruik van zeer lage kleurstof concentraties die niet leiden tot cellulaire artefacten in verband met verzadiging of kleurstof toxiciteit, terwijl nog steeds het verstrekken van goede signaal-ruisverhoudingen voor hoge kwaliteit, op lange termijn live cel beeldvorming.

Met collega's van de afdeling Nucleaire Geneeskunde van de medische universiteit hebben we onlangs deze kleurtechnieken gebruikt om een nieuwe aanpak te ontwikkelen voor beeldgestuurde diagnose van aapergillose. De mogelijkheid om membraan- en celwandstructuren in realtime te monitoren, was cruciaal voor het bepalen van de opnamedynamiek van de experimentele geneesmiddelenverbinding. Om deze procedure te beginnen, eerst een voorbereide precultuur verkrijgen.

Gebruik een steriele scalpel om een klein agarblok te snijden dat niet-sporulerend mycelium van de kolonierand van de precultuur draagt. Plaats het agarblok in het midden van een verse, stevige middelgrote plaat om de experimentele cultuur in te enten. Broed de experimentele cultuur volgens de ontwikkelingsfase bedoeld om te worden geïncubeerd.

Voorbeeldvoorbereiding is enigszins delicaat en optimalisatie van de instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen is vrij complex. Visuele demonstratie van beide procedures vergezeld van verbale uitleg vergemakkelijkt de repliceerbaarheid. Om de monsters te monteren, houd een schone 24 bij 60 millimeter glazen deksel klaar en voeg 18 microliter van vloeibare minimale medium of fysiologische zout oplossing op het centrum.

Voeg twee microliters van de voorbereide 20 micromolar kleurstof werkoplossing aan de vloeistof in het midden van de cover slip en meng goed door pipet op en neer meerdere malen, terwijl het vermijden van de productie van luchtbellen. Met behulp van een schone scalpel, knip een monster van 15 bij 15 millimeter uit de periferie van de kolonie en plaats deze verticaal naast de medium drop op de cover slip. Gebruik de scalpel om de bovenste rand van het blok en een vinger te ondersteunen om de achterkant van het blok op zijn plaats te houden.

Laat vervolgens langzaam de zijkant met het mycelium op de vloeistof zakken. Zet het voorbereide monster op het microscooppodium. Pas eerst de basisinstellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen aan om de permanente dynamiek vast te leggen in individuele hyphae zoals beschreven in het tekstprotocol.

Raadpleeg voor de endocytose-opnametesten figuur één en tabel één van het tekstprotocol om de beste excitatie- en emissie-instellingen voor FM 143 of FM 464 te identificeren die beschikbaar zijn op het microscopiesysteem en deze instellingen in het systeem dienovereenkomstig aan te passen. Start het opnemen van afbeeldingen met behulp van de eerder aangepaste instellingen en evalueer de resultaten. Optimaliseer vervolgens de instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen tot de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is om het aspect van plasmamembraan of endocytosedynamiek vast te leggen waarop het experiment is gericht.

Raadpleeg voor de dynamiek van de celwand figuur vier en tabel één van het tekstprotocol om de beste excitatie- en emissie-instellingen voor de toegepaste celwandkleurstof te identificeren en pas de instellingen op het microscopiesysteem dienovereenkomstig aan. Start het opnemen van afbeeldingen met behulp van de eerder aangepaste instellingen en evalueer de resultaten. Optimaliseer vervolgens de instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen tot de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is om het aspect van de morfogenese van de celwand vast te leggen waarop het experiment is gericht.

Naast het enkel visualiseren van cellulaire processen, maakt live celbeeldvorming extractie van kwantitatieve informatie uit de opgenomen gegevens mogelijk. In een voorbeeld van de FM 464 opnametesten, schimmel monsters worden gekweekt als kolonies en gemonteerd door de omgekeerde agar blok methode. De tests identificeerden gebreken in de spatio-temporele organisatie van endocytose in gende verwijdering en gen dat mutanten van het schimmelspecifieke eiwit SFP 2 van trichoderma atroviride over-uitdrukt.

Voorbeelden van FM 464 co-kleuring van fluorescerende fusie-eiwitten gericht op endocytische compartimenten worden hier getoond. Deze co-kleuring wordt gebruikt om de subcellulaire verdeling van de twee verbeterde groene fluorescerende eiwit gelabeld transmembrane eiwitten, SFP 2 en GPR 1, betrekking hebben op de endocytische route in trichoderma atroviride. Een voorbeeld van FM 464 co-kleuring voor de identificatie van morfogenetische verschillen blijkt dat deze co-kleuring maakt verdere relatie van de subcellulaire lokalisatie dynamiek van flourescently gelabeld BUD-6 polarisme complex eiwit aan het einde van een aantal handel-afhankelijke processen zoals de vorming van septa en gepolariseerde hyphal tip groei.

Het kenmerkt ook verschillen in de subcellulaire organisatie en hyphal architectuur tussen wilde type en mutant stammen van neurospora crassa. Representatieve celwandvlekken tonen aan dat de verschillende interactie-eigenschappen van calcofluorwit, solofenyl flavine en congorood met celwandpolymeren morfogenetische verschillen tussen de delta SFP 2 mutant en de wilde soort stam van trichoderma atroviride benadrukken. Het verhogen van de celwand stress toegebracht door verhoogde kleurstof concentraties gebeurt sneller en is meer uitgesproken in de mutant in vergelijking met het wilde type.

Bovendien zorgen dezelfde beelden voor de kwantificering van morfogenetische verschillen met betrekking tot hyphal diameter en septale afstand tussen beide stammen. Representatieve realtime monitoring van de biosynthese van de celwand geeft aan dat de zeer lage calcofluorwitte concentratie verzadiging van de celwand met kleurstofmoleculen voorkomt en kwantitatieve realtime monitoring van de biosynthese van de celwand mogelijk maakt. Dit toont aan dat de afzetting van nieuw celwandmateriaal niet uniform is, maar zeer snel reageert op gelokaliseerde fysieke spanningen als gevolg van de relatieve verplaatsing van één cel op cel-naar-celbevestiging voorafgaand aan dermalinfusie in neurospora crassa.

Minder is meer. Gebruik zo weinig mogelijk kleurstof om interferentie van de fluorescerende marker met cellulaire processen uit te sluiten. Na deze procedure kan het herstel van de bloemescentie na fotobleekexperimenten worden uitgevoerd om transport en biogenese kinetiek te kwantificeren.

De baanbrekende introductie van membraan- en celwandvlekken in filamenteuze schimmels aan het begin van het millennium heeft letterlijk een revolutie teweeggebracht in de manier waarop we naar schimmels kijken. Calcofluor wit kan oogirritaties veroorzaken en is een geclassificeerde cancerigen. Congo rood is cancerigenic en teratogenic, dus draag oog- en huidbescherming bij het hanteren van deze kleurstoffen.