Volledig verwerkte recombinant KRAS4b: isoleren en karakteriseren van het Farnesylated en gemethyleerd eiwit

Ons protocol maakt isolatie en scheiding van goed verwerkte KRAS bij hoge opbrengst mogelijk. De productie van authentiek vernesylated en carboxymethylated KRAS maakt het mogelijk om experimenten uit te voeren die KRAS in hun membraan hebben, net als in zoogdiercellen. De hoge opbrengst van het protocol onderscheidt het van eerder werk.

We zuiveren meestal drie tot vijf milligram eiwit per liter expressiemateriaal. Dit stelt ons in staat om een verscheidenheid van biofysische en structurele biologie experimenten uit te voeren. KRAS is gemuteerd in 20% van de kankers en 90% in alvleesklierkanker.

Dus het hebben van een protocol om authentiek verwerkt eiwit te produceren is heel nuttig voor het ontwikkelen van medicijnschermen, zodat je het werkelijke eiwit bestuderen zoals het zou zijn op het membraan van kankercellen. Dit protocol is ook zeer nuttig voor het bestuderen van andere eiwitten die zijn farnesylated en volledig verwerkt in de cellen. En als zodanig, alles wat je hoeft te doen is swap uit de KRAS met het eiwit van belang en zet het in het baculovirus.

De kritieke stappen zijn die rond de kationuitwisselingschromatografie. Het gebruik van de juiste kolom en het beperken van de tijd dat het eiwit in een lage zoutbuffer zit zijn essentieel voor succes. Begrijpen dat de neerslag is niet een sneeuwbol type gebeurtenis helpt begeleiden die nieuw zijn bij het protocol.

Dit wordt versterkt door de noodzaak aan te tonen om de kationenwisselkolombelasting in meerdere kleinere ladingen te verdelen. Na het lyseren van cellen, het verduidelijken van het lysaat en het zuiveren van het doeleiwit door IMAC, analyseer je de eiwitfracties met behulp van SDS-pagina en Coomassie-kleuring. Pool de piekfracties en dialyseren het zwembad 's nachts tegen twee liter buffer D op vier graden Celsius.

Verwijder de volgende dag het monster uit de dialyse en vercentrifugeren het gedurende 10 minuten op 4.000 g om eventuele neerslag te verwijderen. Het uiteindelijke dialyseerde en verduidelijkte monster is vaak nog wazig, maar kan zonder verdere verwerking op de CEX-kolom worden toegepast. Bereid 20 milliliter cation uitwisseling kolom door het wassen met drie kolom volumes van buffer G, dan met drie kolom volumes van buffer F.Next, verdun 20 milliliter van het dialyseerde monster om een definitieve natriumchloride concentratie van 100 millimolar door toevoeging van 20 milliliter buffer E en breng het monster aan de uitwisseling kolom.

Het is van cruciaal belang om de kleine hoeveelheid van het monster in plaats van alles tegelijk te verdunnen en de verdunde monsters moeten onmiddellijk na verdunning op de kolom worden aangebracht om de neerslag van het eiwit te beperken. Blijf de kolom laden met vers verdund monster als de vorige verdunning het einde van de belasting nadert. Was vervolgens de kolom naar baseline 280 met buffer F die doorgaans drie kolomvolumes vereist.

Elute het eiwit uit de kolom met een 400 milliliter gradiënt van buffer F tot 65%buffer G, het verzamelen van de eluent in zes milliliter fracties. Zodra het verloop is voltooid, blijft u de kolom wassen voor een extra 1,5 kolomvolumes van 65%buffer G.Kies de positieve breuken op basis van zowel SDS-pagina als Coomassie Blue-vlekanalyse en inspectie van het UV-spoor van het chromatogram. Verbind het eiwit en verteer het met His6 TEV protease volgens de handschriftaanwijzing.

Na de spijsvertering en dialyse, laad het eiwit op een 20 milliliter IMAC kolom geëquilibreerd met buffer A op drie milliliter per minuut. Verzamel zeven milliliterfracties tijdens deze chromatografie en was de kolom met in totaal drie kolomvolumes buffer A of totdat de basislijnabsorptie is bereikt. Elute het doeleiwit met vijf kolomvolumegradiënt van buffer C van 0%tot 10%en verzamel zeven milliliterfracties.

Identificeer vervolgens de positieve breuken met de SDS-pagina. Wanneer geanalyseerd met SDS-pagina, moet het verduidelijkte lysaat een donkere band bevatten die migreert naar ongeveer 65 kilodaltons die overeenkomt met het fusie-eiwit His6-MBP-tev-KRAS4b. De mede-uitgedrukte FNTAb migreert naar 48 kilodaltons.

De CEX-stap binnen de zuivering is van cruciaal belang omdat het de omvang van proteolyse vermindert en het volledig verwerkte eiwit verrijkt, maar het meest gecompliceerde deel van het protocol is. Een typisch resultaat van deze stap heeft een prominente piek drie met de KRAS4b-FMe, maar elutie profielen kunnen variabel zijn. Intacte massaanalyse met behulp van ESIMS bevestigt de precieze moleculaire massa van de eiwitten en daarmee het relatieve aandeel van farnesylation of carboxymethylatie.

Terwijl de typische definitieve partijen sommige detecteerbare KRAS4b-FARN bevatten, was dit aandeel minder dan 15% in termen van piekhoogte van deze analyse. Inheemse massa-analyse werd gebruikt om de massa van de KRAS4b gebonden aan het BBP te bepalen. Het monsteroplosmiddel werd ingeruild voor ammoniumacetaat om een zachtere ionisatie te garanderen, waardoor het inheemse complex intact kon blijven.

De interactie van KRAS4b-FMe en liposomen werd gemeten met oppervlakteplasmon resonantie om de farnesylation en carboxymethylation te valideren die nodig zijn om KRAS4b-FMe aan membranen te binden. Zoals verwacht, KRAS4b-FMe gebonden aan de liposomen, terwijl onbewerkte KRAS4b niet. Het minimaliseren van de tijd dat het eiwit wordt blootgesteld aan zoutarm is het meest kritieke aspect van het protocol dat de opbrengst beïnvloedt.

Het eiwit is slechts kort op deze lage zoutconcentratie na de verdunning in buffer E.Het eiwit kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van biofysische experimenten die membraan mimetica zoals liposomen of nanodiscs gebruiken om te onderzoeken welke lipiden KRAS interageert met. Met behulp van deze gegevens kunnen we beginnen te extrapoleren hoe KRAS interageert met het plasmamembraan van de cel. Met behulp van gezuiverde KRAS-FMe konden onze collega's de röntgenkristalstructuur van KRAS in complex oplossen met een chaperonne die specifiek is voor de farnesylated en gemethyleerde vorm van dit eiwit.