Name: Volledig verwerkte recombinant KRAS4b: isoleren en karakteriseren van het Farnesylated en gemethyleerd eiwit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Leer hoe je volledig verwerkte recombinant KRAS4b isoleert en karakteriseert met hoge opbrengst uit insectcellen. Deze methode maakt biophysische experimenten met farnesylated en gemethyleerd eiwit mogelijk voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We erkennen het klonen en expressie steun van Carissa Grose, Jen Melhalko, en Matt Drew in het proteïne Expression laboratorium, Frederick National Laboratory voor kankeronderzoek. Dit project is geheel of gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het nationaal kanker instituut, National Institutes of Health, onder contract nr. HHSN261200800001E. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het Department of Health and Human Services, noch vermeldt handelsnamen, commerciële producten of organisaties goedkeuring door de Amerikaanse overheid

<ol><li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+prenylation%3A+more+than+just+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li>
<li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Prenylation%3A+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li>
<li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity%3A+implications+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li>
<li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).</li>
<li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pleiotropic+effect+of+statins%3A+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li>
<li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758(2013).</li>
<li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li>
<li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li>
<li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li>
<li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dragging+ras+back+in+the+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li>
<li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910(2012).</li>
<li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-Ras4B+lipoprotein+synthesis%3A+biochemical+characterization%2C+functional+properties%2C+and+dimer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li>
<li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+%284B%29+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li>
<li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li>
<li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li>
<li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79(2019).</li>
<li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li>
<li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect%2Fbaculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li>
<li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE%CE%B4%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanism+of+drug%2FLipid+membrane+interactions+using+Biacore%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li>
<li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li>
<li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Zoals opgemerkt in de representatieve resultaten sectie, de meest kritieke stap tijdens de zuivering is de behandeling van het monster gedurende de tijd dat het in lager zout. Het beperken van de tijd dat het monster wordt blootgesteld aan minder dan 200 mM NaCl zal helpen verminderen neerslag en verhoging van de monster opbrengst. Interpretatie van de resultaten van de CEX kan moeilijk zijn als het profiel niet overeenkomt met de verwachtingen (Zie Figuur 2). Totdat het protocol routine is ...

Posttranslationele modificaties spelen een belangrijke rol bij het bepalen van de functionele activiteit van eiwitten. Wijzigingen zoals fosforylering en glycosylatie zijn goed vastgesteld. Lipide-modificaties zijn echter minder goed gekarakteriseerd. Geschat wordt dat maar liefst 0,5% van alle cellulaire eiwitten kunnen worden prenylated1. Prenylation is de overdracht van een 15-Carbon het of een 20-Carbon geranylgeranyl lipide keten aan een acceptor eiwit met de caax Motif2. Prenylated eiwitten zijn betrokken bij de progressie van verschillende ziekten van de mens, met inbegrip van vroegtijdige veroudering3, Alzheimer4, cardiale disfunctie5, choroideremia6, en kanker7. De kleine gtpases, hri's, nri's, en kras1, nucleaire laminaten, en de kinetochoren cenp-E en F zijn farnesylated eiwitten onder de basale aandoening. Andere kleine GTPases, namelijk RhoA, RhoC, Rac1, CDC-42 en RRAS zijn geranylgeranylated8, terwijl rhob farnesylated of geranylgeranylated9kan zijn.
De kleine GTPase KRAS4b fungeert als een moleculaire switch, in wezen overdracht van extracellulaire groeifactor signalering naar intracellulaire signaaltransductie trajecten die celgroei en proliferatie stimuleren, via meerdere eiwit-eiwit interacties. Er zijn twee belangrijke aspecten van KRAS4b biochemie die essentieel zijn voor haar activiteit. Ten eerste, de eiwit cycli tussen een inactief BBP en een actieve GTP gebonden toestand waarbij het actief met Effectors bezig is. Tweede, een C-terminale poly-lysine regio en een farnesylated en carboxymethylated cysteïne direct het eiwit naar het plasma membraan, waardoor werving en activering van stroomafwaartse Effectors. Mutant KRAS4b is een oncogene driver in pancreatic, colorectale en longkanker10, en als zodanig, therapeutische interventie zou een groot klinisch voordeel hebben. Productie van authentiek gemodificeerd recombinant eiwit dat is farnesylated en carboxymethylated zou biochemische screening mogelijk maken met behulp van KRAS4b in combinatie met membraan surrogaten zoals liposomen of lipide nano schijven11,12.
Het Transferase (fnt) katalyseert de toevoeging van het pyrofosfaat aan de C-terminale cysteïne in het caax motief in KRAS4b. Na prenylatie wordt het eiwit verhandeld aan het endoplasmisch reticulum (er) waar het RAS converting enzym (RCE1) de drie C-terminale residuen Slaid. De laatste stap in de verwerking is methylering van het nieuwe C-terminale farnesylcysteïne residu door het ER membraan proteïne, isoprenylcysteïne carboxylgroep methyltransferase (ICMT). Expressie van recombinant KRAS4b in E. coli resulteert in de productie van een ongemodificeerd eiwit. Eerdere pogingen om verwerkte KRAS4b te produceren zijn beperkt als gevolg van onvoldoende opbrengsten voor structurele of drug screening experimenten of hebben nagelaten om de inheemse full-length volwassen eiwit13,14te recapituleren. Het protocol hier gepresenteerd maakt gebruik van een Engineered Baculovirus gebaseerde insect Cell expressie systeem en zuiveringsmethode die zeer gezuiverde, volledig verwerkte KRAS4b genereert bij rendementen van 5 mg/L celcultuur.
Zorgvuldige eiwit karakterisering is essentieel voor het valideren van de kwaliteit van recombinant eiwitten voorafgaand aan het beginnen met structurele biologie of drug screening studies. Twee belangrijke parameters van volledig verwerkte KRAS4b zijn validatie van de juiste prenyl-modificatie en de beschikbaarheid van de farnesylated en carboxymethylated C-Terminus (FMe) voor interactie met membraan vervangers of lipiden. Elektro spray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) van de KRAS4b-FME werd gebruikt om het molecuulgewicht te meten en de aanwezigheid van de het en Carboxymethyl modificaties te bevestigen. Inheemse massaspectrometrie, waarbij monsters worden besproeid met niet-denaturerende oplosmiddelen, werd gebruikt om aan te tonen dat KRAS4b-FMe ook gebonden was aan zijn BBP cofactor. Ten slotte werd oppervlak Plasmon resonantie spectroscopie gebruikt om de directe binding van KRAS4b-FMe met geïmmobiliseerde liposomen te meten.

<table><tbody><tr><td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td><td>Thermo Scientific</td><td>30211SS-1232</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td>850457</td><td>aanschaffen als vloeibare voorraad in chloroform</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td>840034</td><td>aanschaffen als vloeibare voorraad in chloroform</td></tr><tr><td>5427R Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC Grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>A998-1 1L</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09689-250g</td><td></td></tr><tr><td>Argon gas</td><td>Airgas</td><td>ARUP</td><td></td></tr><tr><td>Assay Plate 384</td><td>CORNING</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200 Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blue Snap-It Seals, T/S</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4011-54B</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonic Bath</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-336-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cation Exchange Chromatography (CEX) column</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29018183</td><td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Dyna Pro Plate Reader</td><td>Wyatt Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exactive Plus EMR Mass Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500Ml</td><td>Gebruik Reagent Grade of beter</td></tr><tr><td>Gilson vials 7x14 mm Tubes</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-12</td><td></td></tr><tr><td>Glass screw thread vials with PTFE foam liners</td><td>Scientific Specialities</td><td>B69302</td><td></td></tr><tr><td>High speed/benchtop centrifuge</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-112-114D</td><td>in staat tot maximaal 4.000 xg</td></tr><tr><td>His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td><td>Addgene</td><td>92414</td><td>Gezuiverd volgens Raran-Kurussi et al. (2017) Verwijdering van affiniteitstags met TEV-protease. In: Burgess-Brown N. (red.) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY</td></tr><tr><td>Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9365-51</td><td>HisPrep FF 16/10</td></tr><tr><td>In-House Water Supply, Arium Advance</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>Weerstand van 18 M&Omega;0-cm</td></tr><tr><td>Lipid extruder set with holder</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>Airgas</td><td>NI-DEWAR</td><td></td></tr><tr><td>M110-EH microfluidizer</td><td>Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>088645</td><td></td></tr><tr><td>MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 &Aring;, 2.1 x 150 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>088790</td><td></td></tr><tr><td>MagTran software</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol, HPLC Grade</td><td>VWR Chemicals</td><td>BDH20864.400</td><td></td></tr><tr><td>NGC Chromatography System</td><td>BioRad</td><td>78880002</td><td>NGC QuestTM 100 Chromatography system</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Caps type 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-02</td><td></td></tr><tr><td>Series S Sensor Chip L1</td><td>GE Healthcare</td><td>29104993</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>13-400-519</td><td>Absorptie bij 280nm</td></tr><tr><td>Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>PES membraan</td></tr><tr><td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters</td><td>Amicon</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima - L80K</td><td>in staat tot 100.000 xg</td></tr><tr><td>Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Fisher</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Water, HPLC Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-1L</td><td>Mag gebruik maken van de waterbron van het bedrijf (zie hieronder)</td></tr><tr><td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter</td><td>GE Healthcare - Whatman</td><td>6994-2504</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur QualBrowser</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>proteomics software</td></tr></tbody></table>

volledig verwerkte recombinant kras4b: isoleren en karakteriseren van het farnesylated en gemethyleerd eiwit

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Eiwit prenylatie is een belangrijke modificatie die verantwoordelijk is voor het richten van eiwitten op intracellulaire membranen. KRAS4b, dat wordt gemuleerd in 22% van de menselijke kankers, wordt verwerkt door farnesylatie en carboxymethylatie als gevolg van de aanwezigheid van een ' CAAX ' vak motief bij het C-Terminus. Een Engineered Baculovirus systeem werd gebruikt om farnesylated en carboxymethylated KRAS4b in insecten cellen uit te drukken en is eerder beschreven. Hier beschrijven we de gedetailleerde, praktische zuivering en Biochemische karakterisering van het eiwit. Met name werden affiniteit en ionenwisselingschromatografie gebruikt om het eiwit te zuiveren tot homogeniteit. Intact en inheemse massaspectrometrie werd gebruikt voor het valideren van de juiste modificatie van KRAS4b en om te controleren of nucleotide binding. Tot slot werd de membraan vereniging van farnesylated en carboxymethylated KRAS4b aan liposomen gemeten met behulp van oppervlakte Plasmon resonantie spectroscopie.

Een van de grootste variabelen in het protocol is de hoeveelheid uitgedrukt doel proteïne (His6-MBP-TeV-KRAS4b). Dit protocol werd ontwikkeld met behulp van een isolaat uit een Trichoplusia ni cellijn, TNI-FNL17, aangepast voor de groei van de suspensie en gespeende uit serum. Gezien het brede scala van resultaten gerapporteerd over de verschillende insecten cellijnen met de Baculovirus expressie systeem, is het raadzaam dat TNI-FNL worden gebruikt, althans aanvankelijk, om KRAS4b-FMe gep...

Prenylatie is een belangrijke modificatie op perifere membraan bindende eiwitten. Insecten cellen kunnen worden gemanipuleerd om gefarnesylen carboxymethylated KRAS4b te produceren in hoeveelheden die biofysische metingen van eiwit-eiwit-en proteïne-lipide-interacties mogelijk maken

Volledig verwerkte recombinant KRAS4b: isoleren en karakteriseren van het Farnesylated en gemethyleerd eiwit

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Ons protocol maakt isolatie en scheiding van goed verwerkte KRAS bij hoge opbrengst mogelijk. De productie van authentiek vernesylated en carboxymethylated KRAS maakt het mogelijk om experimenten uit te voeren die KRAS in hun membraan hebben, net als in zoogdiercellen. De hoge opbrengst van het protocol onderscheidt het van eerder werk.We zuiveren meestal drie tot vijf milligram eiwit per liter expressiemateriaal. Dit stelt ons in staat om een verscheidenheid van biofysische en structurele biologie experimenten uit te voeren. KRAS is gemuteerd in 20% van de kankers en 90% in alvleesklierkanker.Dus het hebben van een protocol om authentiek verwerkt eiwit te produceren is heel nuttig voor het ontwikkelen van medicijnschermen, zodat je het werkelijke eiwit bestuderen zoals het zou zijn op het membraan van kankercellen. Dit protocol is ook zeer nuttig voor het bestuderen van andere eiwitten die zijn farnesylated en volledig verwerkt in de cellen. En als zodanig, alles wat je hoeft te doen is swap uit de KRAS met het eiwit van belang en zet het in het baculovirus.De kritieke stappen zijn die rond de kationuitwisselingschromatografie. Het gebruik van de juiste kolom en het beperken van d

fully-processed-recombinant-kras4b-isolating-characterizing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit protocol beschrijft de productie van KLRG1 tetrameer, dat is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van KLRG1 liganden.

Een protocol voor de productie van KLRG1 tetrameer

This video demonstrates the cation exchange chromatography technique to isolate recombinant protein from the insect cell protein lysate.

Cation Exchange Chromatography: A Technique to Isolate Target Recombinant Protein from Insect Cell Lysate Based on Net Surface Charge

DNA-methylatie is in staat om stabiele niveaus van genregulatie te handhaven, evenals dynamische veranderingen in genregulatie mogelijk te maken als reactie op verschillende stimuli. We beschrijven technieken die het mogelijk maken om gen-specifieke veranderingen in DNA-methylatie en de invloed van deze veranderingen op genregulatie te bestuderen.

Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

MRP4 regelt diverse cyclisch nucleotide-afhankelijke signalering evenementen, waaronder een recent opgehelderd rol in cel migratie. We beschrijven een directe, maar veelzijdige benadering van de downstream-moleculaire doelwitten van MRP4 resulteert in de identificatie van een unieke MRP4 interactoom die een belangrijke rol in de fine tuned regulering van de fibroblast migratie speelt ontrafelen.

Methoden om-MRP4 bevattende macromoleculaire complexen studie in de verordening van fibroblast migratie

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

We hebben een werkwijze voor het zuiveren van eiwitten mederegulerende interactie met de LC-MS / MS systeem.

Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van RNA, DNA en eiwit uit hetzelfde monster, in een poging om de variatie te reduceren, reproduceerbaarheid te verbeteren en vergemakkelijken van interpretaties.

Gecombineerde Nucleotide en eiwit extracties in Caenorhabditis elegans

Wij presenteren experimentele benaderingen voor studeren RNA-interactors van double-stranded RNA bindend proteïne kinase RNA-geactiveerd (PKR) tijdens de zoogdieren celcyclus met behulp van HeLa cellen. Deze methode maakt gebruik van formaldehyde dwarslijn RNA-PKR complexen en immunoprecipitation te verrijken van PKR-gebonden RNAs. Deze RNAs kunnen verder worden geanalyseerd door middel van high-throughput sequencing of qRT-PCR.

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

Expressie en zuivering van fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten wordt beschreven met voorbeelden (expressie in E. coli, FPLC). De gezuiverde proteïnen worden gebruikt voor kristallisatie en antilichamenproductie en in dienst genomen voor enzym analyses. De geselecteerde fotometrische analyses worden voorgesteld om de multi-functionaliteit van FAHD1 als Oxaloacetaat decarboxylase en acylpyruvate hydrolase te tonen.

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Deze protocollen bieden de methodologie die wordt gebruikt om de enzymatische activiteit van individuele leden van de eiwit arginine methyltransferase (PRMT) familie in cellen te beoordelen. Gedetailleerde richtlijnen voor het beoordelen van PRMT-activiteit met behulp van endogene en exogene biomarkers, methyl-arginine-herkennende antilichamen en remmertoolverbindingen worden beschreven.

Kwantitatieve methoden voor het bestuderen van eiwit Arginine Methyltransferase 1-9 activiteit in cellen

Dit protocol beschrijft de productie van recombinante humane SLFN14-ribonuclease en de stoichiometrische analyse daarvan door massafotometrie.<br...

Snelle productie van recombinante menselijke SLFN14-ribonuclease en stoichiometrische analyse door massafotometrie

Leer hoe je volledig verwerkte recombinant KRAS4b isoleert en karakteriseert met hoge opbrengst uit insectcellen. Deze methode maakt biophysische experimenten met farnesylated en gemethyleerd eiwit mogelijk voor kankeronderzoek.

Volledig verwerkte recombinant KRAS4b: isoleren en karakteriseren van het Farnesylated en gemethyleerd eiwit

Meer video's verkennen