Gecombineerde voorwaardelijke knockdown en aangepaste sphere vorming test om een stemness-geassocieerd gen van patiënt-afgeleide maagkanker stamcellen studie
9 mei 2020
In dit protocol presenteren we een experimenteel ontwerp met behulp van een voorwaardelijk knockdown-systeem en een aangepaste bolvormingstest om het effect van clusterin op de stamheid van door de patiënt afgeleide GCSCs te bestuderen. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om zowel in vitro als in vivo functie van stamheid-geassocieerde genen in verschillende soorten CSCs te bestuderen.
Kanker stamcellen zijn betrokken bij kanker teruggevallen metastase op resistentie tegen geneesmiddelen. Dit protocol biedt een efficiënte methode voor het onderzoeken van de functies van de belangrijkste genen in kankercellen. Met behulp van een voorwaardelijke knockdown systeem en aangepaste bolvorming test, is deze methode gemakkelijk aangepast aan in vitro en in vivo functies op stamheid-geassocieerde genen in verschillende soorten kanker stamcellen te bestuderen.
Het aantonen van de procedure, zal Yuting Li en Xiangyu Tan, onderzoeksassistenten van mijn laboratorium. Voor het genereren van lentivirusdeeltjes, zaad vier miljoen 293T lentivirale verpakkingscellen in een 100 millimeter petrischaal met 10 milliliter DMEM aangevuld met 10%FBS. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius en 5%kooldioxide, ervoor te zorgen dat de cellen zijn 50 tot 80%confluent op de dag van transfectie.
Breng verlaagd serum medium tot kamertemperatuur en bereid buizen A en B volgens manuscriptaanwijzingen. Voeg de inhoud van buis A toe aan buis B.Meng goed en broed de buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om lipide-DNA complexen voor te bereiden. Verwijder vijf milliliter medium uit de celkweekschotel.
Voeg vervolgens vijf milliliter van het lipide-DNA-complex toe aan de celkweekschaal laat wijs vallen en draai de schotel voorzichtig. Broed het kweekgerecht 24 uur lang uit bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Verwijder na de incubatie het transfectiemedium voorzichtig en vervang het door 10 milliliter voorverwarmde DMEM aangevuld met 10%FBS.
Incuberen de cellen voor nog eens 24 uur. Ongeveer 48 uur na de transfectie, oogst 10 milliliter lentivirus met supernatants en filter ze met een 0,45 micrometer gietfilter om cellulair puin te verwijderen. Alle celkweekvaten, tips, filters en spuiten kunnen lentivirus bevatten en moeten vóór verwijdering met 10% bleekmiddel worden behandeld.
Breng een verduidelijkte supernatant over naar een steriele container. Voeg Lenti-X concentrator toe en meng met zachte inversie. Incubeer het mengsel op vier graden Celsius 's nachts.
Op de volgende dag, centrifuge het monster op 1500 keer G gedurende 45 minuten op vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig de supernatant, waarbij u ervoor zorgt dat de pellet aan de onderkant niet wordt verstoord. Voorzichtig opnieuw op te schorten de pellet in een milliliter van DMEM aangevuld met 10%FBS en bewaar het op min 80 graden Celsius.
Zaad 6 miljoen maagkanker stamcellen of GCSC's in een 100 millimeter petrischaal met 10 milliliter DMEM aangevuld met 10%FBS. Kweek de cellen 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Wanneer de cellen bereiken 70 tot 80%confluency, aspirate het medium uit de schotel en voeg de geconcentreerde lentivirale deeltjes verdund met vier millimeter van de volledige DMEM medium, met Polybrene reagens.
Breng de cellen 18 uur terug naar de couveuse. Polybrene moet worden getest in verschillende omstandigheden om de effectieve concentratie te bepalen, die meestal in het bereik van twee tot 10 milligram per milliliter. Vervang na 18 uur het medium door 10 milliliter DMEM met 10%FBS en breng de cellen 24 uur terug naar de couveuse.
Dan, aspirate de supernatant met de cel puin en voeg verse DMEM aangevuld met 10%FBS en 2,5 microgram per milliliter puromycine. Incuberen de cellen voor nog eens 24 uur. Verander vervolgens het medium weer in verse DMEM aangevuld met 10%FBS en vijf microgram per milliliter Puromycine.
Na nog een 24-uurs incubatie spoel je de aanhangende GCSCs twee keer af met vijf milliliter DPBS zonder calcium en magnesium. Dissociate de cellen met een milliliter voorverwarmde celdissociatieoplossing en broed ze twee tot drie minuten uit bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens vijf milliliter verse voorverwarmde GCSC complete kweekmedium toe aan de celsuspensie.
Doe drie milliliter van deze suspensie in een 15 milliliter centrifugebuis voor cryopreservatie, en de andere drie milliliter in een andere buis voor inductie met doxycycline. Centrifuge beide buizen op 800 keer G gedurende vijf minuten. Vervolgens, aspirate de supernatant uit buis B en opnieuw opschorten van de cellen in een milliliter van verse voorverwarmde GCSC complete cultuur medium.
Zaad een passend aantal cellen in een nieuwe 100 millimeter petrischaal met 10 milliliter verse voorverwarmde GCSC complete cultuurmedium en 2,5 microgram per milliliter doxycycline. Vervolgens, incubeer de schotel voor 48 uur. Gebruik een geautomatiseerde celteller om de dichtheid van een 10 microliter monster van cellen te bepalen.
Pas vervolgens het volume aan met voorverwarmd GCSC complete kweekmedium om een concentratie van 20.000 levensvatbare cellen per milliliter te verkrijgen. Doe 100 microliter van de celsuspensie in elke put van een nieuwe, ultra lage bevestiging 96 goed kweekplaat. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.
De vorming van de bol moet binnen drie tot tien dagen plaatsvinden. Beeld de tumor bol vorming om de twee dagen. Maagkanker stamcellen van primaire menselijke maag adenocarcinoom werden gekweekt in serum vrije cultuur medium.
Na zes dagen breidden cellen zich uit van de eencellige als fenotype naar grote bollen. Om de functie van clusterin in GCSCs te beoordelen, werden korte haarspeldRNA-sequenties tegen clusterin gekloond in de Tet-GV307-RFP-Puro vector. Cellen die met de expressievector werden doorgetast, werden gedurende 48 uur behandeld met doxycycline.
Vervolgens werd de clusterinexpressie geverifieerd door westerse vlek en gekwantificeerd door densitometrie. De aanwezigheid van doxycycline en knockdown van clusterin in GCSCs remde tumorsfeervorming. Terwijl er geen remming van tumor bol vorming werd waargenomen in cellen getransduceerd met de roerei shRNA controles, wat aangeeft dat doxycycline alleen niet remmen tumor sfeervorming.
Deze resultaten suggereren dat na clusterin uitschakeling, GCSCs langzaam groeien en geen tumorbollen kunnen vormen. Op basis van deze gegevens speelt clusterin een cruciale rol bij het bevorderen van de zelfvernieuwingsactiviteit van GCSCs, wat aangeeft dat het een veelbelovend medicijndoel zou kunnen zijn voor het onderdrukken van kankerstamcellen bij maagkankerpatiënten. De tumoren bollen moeten worden solide ronde structuren op individuele of geaggregeerde cellen, mag niet worden beschouwd als tumor bollen.
Echter, sommige kanker stamcellen kunnen niet vormen typische tumor bol structuren. Deze procedure kan worden gevolgd met andere methoden om kanker stamcellen te onderzoeken voor hernieuwbare potentiële in vitro. Zo kan bijvoorbeeld de expressie van stemheidsgerelateerde markers worden bestudeerd.
Het protocol kan worden uitgebreid om de functies van de kritische genen in kankerstamcellen te bestuderen, zoals stamheid bij overleving.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een experimenteel ontwerp dat gebruikmaakt van een conditioneel knockdown-systeem en een aangepaste bolvormingstest om het effect van clusterin op de stamcel-eigenschappen van door patiënten afgeleide GCSC's te bestuderen. Het kan eenvoudig worden aangepast voor zowel in vitro als in vivo studies van stamcel-geassocieerde genen in verschillende soorten kanker stamcellen.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Kankerbiologie
- Stamcellenonderzoek
- Genfunctieanalyse
Achtergrond
- Kanker stamcellen (CSC's) dragen bij aan kankerrecidieven en metastasen.
- Het begrijpen van de rol van specifieke genen in CSC's is cruciaal voor het ontwikkelen van gerichte therapieën.
- Dit protocol richt zich op het gen clusterin en zijn impact op stamcel-eigenschappen.
- De methode staat toe flexibel te worden toegepast in verschillende kankertypes.
Doel van het onderzoek
- Om de rol van clusterin in de stamcel-eigenschappen van door patiënten afgeleide GCSC's te onderzoeken.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van stamcel-geassocieerde genen.
- Om de begrip van CSC biologie en potentiële therapeutische doelwitten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Conditioneel knockdown-systeem voor gen-silencing.
- Aangepaste bolvormingstest om stamcel-eigenschappen te beoordelen.
- In vitro en in vivo experimentele ontwerpen.
- Gebruik van lentivirale deeltjes voor gen-levering.
Belangrijkste resultaten
- Demonstreerde de procedure voor het genereren van lentivirale deeltjes.
- Bijgebracht inzichten in de effecten van clusterin op GCSC's.
- Toonde de aanpasbaarheid van de methode voor verschillende CSC typen.
- Benadrukte het belang van het bestuderen van stamcel-geassocieerde genen.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het bestuderen van de rol van clusterin in kanker stamcellen.
- Het kan worden aangepast voor verschillende soorten kanker stamcellen.
- Dit onderzoek kan leiden tot nieuwe inzichten in kankerbehandelingsstrategieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of stemness-associated genes in patient-derived gastric cancer stem cells, supporting target validation in oncology discovery. By combining conditional knockdown with an adapted sphere formation assay, it provides quantitative, reproducible readouts for assessing gene function in cancer stemness pathways. The approach enhances predictive confidence in early-stage target selection and portfolio prioritization for gastric cancer therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking clusterin knockdown to reduced sphere formation, clarifying its role in GCSC self-renewal.
- Operational Value: Enables functional target validation through inducible, reversible gene silencing in a disease-relevant system.
- Predictive Value: Supports preclinical go/no-go decisions by demonstrating that clusterin inhibition impairs tumorigenic potential in vitro.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable sphere formation metrics suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Uses lentiviral delivery and puromycin selection to ensure consistent knockdown efficiency across experiments.
- Scalability: Compatible with 96-well ultra-low attachment plates, enabling parallel testing of multiple genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses patient-derived gastric cancer stem cells, maintaining phenotypic fidelity to human tumor biology.
- Translational Continuity: Bridges in vitro stemness assessment with potential in vivo validation of clusterin as a therapeutic target.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic evidence to prioritize clusterin in preclinical pipelines targeting cancer stem cell-driven relapse and resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling target validation after initial hit identification and before lead optimization in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking gene knockdown to functional stemness outcomes via sphere formation.
- Screening: Generates quantitative, imaging-based readouts that can be automated for compound or genetic suppressor screens.
- Analytics: Enables densitometric analysis of Western blots and sphere quantification for objective comparison of genetic conditions.
- Translational Research: Connects in vitro stemness phenotypes to potential in vivo models through conserved assay adaptability.
- Enterprise Reuse: The conditional knockdown-sphere formation platform is reusable across stemness-associated genes and cancer types beyond gastric cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stemness gene function through inducible, reversible knockdown in primary-derived cells.
- Operational Value: Standardizes stemness assessment via sphere formation, improving inter-lab reproducibility and assay transferability.
- Strategic Value: Increases confidence in target selection by providing causal evidence linking gene suppression to loss of tumorigenic potential.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets like clusterin based on functional validation in patient-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral production, cell culture, and molecular biology techniques including transfection and selection.
- Depends on access to ultra-low attachment plates, automated cell counters, and Western blotting infrastructure for validation.
- Necessitates standardization of doxycycline induction and puromycin selection timing across laboratories for consistent knockdown.
- Requires optimization of polybrene concentration and lentiviral titer for efficient transduction of primary gastric cancer stem cells.
- Limited by the dependency on sphere formation as a stemness readout, which may not capture all stemness phenotypes in heterogeneous cultures.
