Het meten van Erythroocyte Complement Receptor 1 met behulp van Flow Cytometrie

Dit protocol kan worden gebruikt om het aantal antigene sites op cellulaire receptor van belang te meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het robuuste resultaten produceert, zelfs voor receptoren uitgedrukt bij een lage dichtheid. Deze methode maakt de evaluatie van de vermindering van CR1 erythrocyte expressie en dit is zoals de ziekte van Alzheimer, systemische lupus erythematosus, AIDS, en malaria.

Dit protocol is nuttig voor elke analyse van de dichtheid van de celreceptor en kan ook worden toegepast op de studie van celreceptorexpressie door fluorescentiemicroscoop. We raden aan om de buizen tijdens de cel- en antilichaamverdeling uit te spreiden en zo mogelijk vergezeld te gaan van een cytometrische specialist. Visuele demonstratie van de immunostaining en dichtheid kwantificering door flow cytometrie is van cruciaal belang om te begrijpen hoe de analyseparameters goed in te stellen.

Voeg voor aanvang van de analyse 250 microliter natrium EDTA-antistollingsbloed uit bloedopslagbuizen toe in een 50 milliliter conische buis met 20 milliliter van vier graden Celsius PBS-BSA. Meng de buisinhoud door zachte inversie en draai de cellen door centrifugatie. Gebruik een pipet van 10 milliliter om de supernatant weg te gooien en de pellet voorzichtig opnieuw op te steken in het resterende volume van de oplossing.

Voeg 20 milliliter koude PBS-BSA toe en centrifuge de cellen opnieuw. Plaats aan het einde van de centrifugatie de buis in een rek, plaats op ijs en breng acht microliter van de gewassen erytrocyten over in een buis van 50 milliliter met drie milliliter PBS-BSA. Meng vervolgens de erytrocyten voorzichtig door te spinnen om een homogene celsuspensie te verkrijgen.

Voor erythrocyte immunostaining, breng voorzichtig 100 microliter van de verdunde erytrocyten over in individuele 1,5 milliliter buizen en verzamel de rode bloedcellen door centrifugatie. Voeg na het weggooien van de supernatants voorzichtig 20 microliter van een 0,5 microgram per microliterconcentratie biotinylated anti-CR1 J3D3-antilichaam in PBS-BSA, rechtstreeks aan elke pellet. Voeg 20 microliter PBS-BSA buffer alleen toe aan de negatieve controlecellen met zachte menging en ontcubeer de monsters gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius.

Aan het einde van de incubatie was je de monsters twee keer met 750 microliter verse PBS-BSA per buis, per wasbeurt. Voeg na de tweede wasbeurt 20 microliter van een één tot 10 verdunning van streptavidin fycoerythrin in PBS-BSA toe aan elke buis met zachte menging en broed de monsters gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius uit. Aan het einde van de incubatie, was de monsters twee keer, zoals aangetoond.

Na de tweede wasbeurt, bevestig elke cel monster pellet met 450 microliter fixatie buffer tijdens vortexing, alvorens elk monster in individuele vijf milliliter ronde bodembuizen voor maximaal 48 uur opslag op vier graden Celsius. Als u de immunostained erytrocyten voor stroomcytometrie wilt analyseren, klikt u op de nieuwe experimentknop in de stroomcytometer en wijzigt u de naam van het nieuwe experiment. Selecteer voorwaartse spreiding, zijverstrooiing en PE in het venster cytometerinstellingen.

Selecteer in het geopende experiment toepassingsinstellingen voor cytometerinstellingen en maak een globaal werkblad met behulp van de grijze vakken en kruisharen om de optimalisatie te begeleiden. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, laadt u de niet-bevlekte controlebuis op de cytometer en voert u de acquisitie uit, waarbij de voorwaartse en zijverstrooiingsspanningen worden geoptimaliseerd om vuil te elimineren en om ervoor te zorgen dat de populatie van belang op schaal is. Trek vervolgens een poort rond de rode bloedcellen op de voorwaartse versus zijverstrooiingsplot en geef de rode bloedcelpopulatie weer in de stipplot van PE-fluorescentie.

Als de positieve populaties op schaal zijn, laadt u de bevlekte controlebuis op de cytometer en voert u de acquisitie uit. Als u monsters wilt opnemen en analyseren, lost u het gekleurde monster en maakt u een voorwaartse versus zijverstrooiingsplot en een PE-fluorescentie-histogram op een nieuw globaal werkblad. Laad het eerste monster op de cytometer, voer de acquisitie uit en trek een rode bloedcelpoort rond de erytrocyten in het voorwaartse versus zijverstrooiingsperceel.

Geef de rode bloedcelpopulatie weer in het PE fluorescentie histogram en selecteer onder het tabblad statistieken het gemiddelde voor de PE-fluorescentieparameters voor rode bloedcelpopulaties. Selecteer in het acquisitiedashboard alle gebeurtenissen in de stopgate en 10.000 gebeurtenissen om gegevens op te nemen en klik op recordgegevens. Wanneer de gebeurtenis-opname is voltooid, verwijdert u de buis uit de cytometer.

De globale werkbladplots moeten er als geïllustreerd uitzien. Flow cytometrische analyse van immunovlektetrocyten van drie proefpersonen van bekende CR1-dichtheden maakt het mogelijk om de gemiddelde fluorescentieintensiteit van de etikettering voor elk onderwerp te meten. Door een curve uit te plotten met behulp van de waarden van het onderwerp met de bekende dichtheid van erythrocyte CR1, kunnen deze gegevens worden gerapporteerd als een functie van de gemiddelde fluorescentieintensiteit.

Vergelijking van de regressielijn als gevolg van deze curve met de waarden van de gemiddelde fluorescentieintensiteit van de andere proefpersonen maakt het mogelijk hun CR1 erythrocytendichtheid te bepalen. Zorg ervoor dat de erytrocyten en antilichamen goed worden verdeeld, zodat de kalibratiecurven van de geëxperimenteerde monsters op de negatieve controle binnen het bereik van de cytometer-instellingen liggen. Het is mogelijk om deze procedure aan te passen om andere cellulaire dichtheidreceptoren te meten, simpelweg door het primaire antilichaam te veranderen en/of de versterkingslagen aan te passen.

Wanneer u bloed behandelt, bestaat het risico op besmetting met ziekteverwekkers. Zorg er daarom voor dat u goede laboratoriumpraktijken gebruikt en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.