Name: Een muismodel van onvolledig gereseceerde weke delen Sarcoom voor het testen van (Neo)adjuvante therapieën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Leer een muismodel van onvolledig gereseceerde weke delen sarcoom voor het testen van (neo)adjuvante therapieën. Deze methode standaardiseert residuale tumor en wondheling voor preklinisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Sock het aan Sarcoma! Stichting, de Australische en Nieuw-Zeelandse Sarcoma Association, de Children's Leukemie & Cancer Research Foundation en Perpetual Philanthropy. W.J.L wordt ondersteund door een Simon Lee Fellowship en een onderzoeksbeurs van de National Health and Medical Research Council, en de Cancer Council WA.

Dieren die bij deze experimenten werden gebruikt, werden verkregen van het Animal Resource Centre (Perth, West-Australië). Dieren werden onderhouden onder standaard pathogene-vrije omstandigheden aan het Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, West-Australië). Alle experimenten werden uitgevoerd volgens het protocol zoals goedgekeurd door het Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee. BALB/c muizen van 8-12 weken oud werden gebruikt in deze experimenten. De WEHI 164 fibrosarcoma cellijn werd verkregen van CellBank Australia (Westmead, NSW).
1. Inenting van cellen
<ol><li>Bereiding van cellen en dieren<ol>
<li>Zorg ervoor dat de cellijn in de aanbevolen media wordt gehandhaafd. Houd bijvoorbeeld de WEHI 164-cellijn in het Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 2 mM L-glutamine, 10% foetale runderserum, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomcine. OPMERKING: Passagecellen ten minste 3 en tot 5 keer nadat ze uit cryogene opslag zijn verwijderd. Om een optimale cel levensvatbaarheid te garanderen, cellen moeten worden gesplitst wanneer ze tussen 70-80% confluent. Tumorcellijnen moeten worden getest op mycoplasma, omdat infectie de celgroei kan veranderen en de immuunrespons in vivo kan beïnvloeden.</li>
		<li>Een dag voor inenting scheer je muizen op de rechterflank met behulp van tondeuse. OPMERKING: Vrouwelijke BALB/c muizen, tussen 8-12 weken, van normaal gewicht (16 -22 gram) werden gebruikt in dit experiment.</li>
		<li>Op de dag van inenting, oogst WEHI 164 cellen wanneer 70-80% confluent door trypsinization.<ol>
<li>Het kweekmedium uit de weefselkweekkolven aanzuigen en vervolgens steriele fosfaatbuffers (1x PBS) toevoegen om de resterende sporen van foetaal runderserum (FBS) te verwijderen.</li>
			<li>Aspirate de PBS uit de weefselkweekkolven. Voeg 3 mL van 0,05% trypsine (voor een T75 kolf) toe en draai de kolf zodat het hele oppervlak van de kolf met cellen bedekt is met trypsine.</li>
			<li>Incubeer de kolf bij 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 3 min. Controleer de cellen periodiek, door op de zijkanten van de kolf te tikken om te zien of de cellen zijn losgemaakt.</li>
			<li>Verwijder kolven uit de celkweek incubator en voeg 5 mL media aangevuld met FBS om de trypsine te neutraliseren. OPMERKING: Laat cellen niet langer in trypsine achter dan nodig is, omdat dit cellen kan beschadigen en kan leiden tot een lage cel levensvatbaarheid.</li>
			<li>Pipet vering meerdere keren om een enkele cel schorsing te verkrijgen. Breng celsuspensie over naar een kegelvormige centrifugebuis.</li>
			<li>Pelletcellen door te draaien op 350 x g gedurende 3 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Was de cellen drie keer in 1x PBS.<ol>
<li>Resuspend cellen in 50 mL steriele 1x PBS en was cellen door pipetten cel suspensie op en neer. Pelletcellen door te draaien op 350 x g gedurende 3 min.</li>
			<li>Aspirate de supernatant en resuspend cellen in 15 mL steriele 1x PBS. Was cellen door pipetten cel suspensie op en neer. Pelletcellen door te draaien op 350 x g gedurende 3 min.</li>
			<li>Aspirate de supernatant en resuspend cellen in precies 10 mL steriele 1x PBS. Was cellen zoals in stap 1.1.4.2 en breng een kleine hoeveelheid (ongeveer 100 μL) celsuspensie over naar een centrifugebuis om te tellen. Pelletcellen door te draaien op 350 x g gedurende 3 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bepaal het celnummer met behulp van de trypan blauwe uitsluitingsmethode met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller. Resuspend cellen in steriele 1x PBS bij een concentratie van 5 x 106 cellen/mL. Houd celopsusopening op ijs. OPMERKING: De levensvatbaarheid van tumorcellen moet gelijk of meer dan 80 % zijn om reproduceerbare tumorgroei te garanderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Onderhuidse inenting<ol>
<li>Meng de celsuspensie grondig en vul een spuit met een 26 G naald met 100 μL celsuspensie (5 x 105 cellen) in steriele 1x PBS. Herhaal het mengen van cellen voordat u de volgende spuit laadt. OPMERKING: Houd cellen in de hele procedure op ijs om de levensvatbaarheid te behouden.</li>
		<li>Beperk de muis op de juiste manier, zodat de toegang tot de rechterflank onder te gaan. Inenting van de muis onderhuids op de geschoren rechterflank. OPMERKING: Zorg ervoor dat de inenting zich niet in het buikvlies bevindt door de naald iets op te tillen, wat zichtbaar moet zijn onder de huid. Een bellen-achtige knobbel moet vormen onder de huid na inenting.</li>
		<li>Controleer muizen zoals vereist door de toepasselijke ethische goedkeuring en voer chirurgische resectie uit wanneer de tumoren zijn gegroeid tot een grootte van ongeveer 50 mm2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Gedeeltelijke chirurgische resectie van de tumor
OPMERKING: Dit protocol vereist TWEE onderzoekers; een voor chirurgische ingrepen (CHIRURG), en een andere voor muismonitoring (ASSISTANT).
<ol><li>Chirurgie setup<ol>
<li>Op dag 12 na de inenting, wanneer tumoren een grootte van ongeveer 50 mm2hebben bereikt, dosismuizen met 100 μL (0,1 mg/kg) buprenorfine s.c. in de scruff van de nek, 30 minuten voor de operatie.</li>
		<li>Zet het chirurgische gebied met een warmtekussen bedekt met bankjas en zet een neuskegel voor anesthesie. Steriliseren chirurgische instrumenten voorafgaand aan het gebruik, en tussen elk dier met behulp van een warmte kraal sterilisator, waardoor gereedschappen om af te koelen voor gebruik. Laat de volgende chirurgische apparatuur schoon en binnen handbereik: chloorhexidine, wattenstaafje, gaas, ooggel, twee gebogen tangen, schaar, clip applicator, clip remover, clip vullingen (Figuur 2A, 2B).</li>
		<li>Verwarm de verwarmingskamer tot 37 °C en zet een ander warmtekussen voor terugwinning op (figuur 2C). Plaats gesteriliseerde gereedschappen op een steriel oppervlak, zoals autoclaved pads.</li>
	</ol></li>
	<li>Anesthesie<ol>
<li>Plaats de muis in de inductiekamer en verdoven de muis met 4% isoflurane (4% in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 1 L/min) totdat de ademhaling vertraagt tot ongeveer 60 ademhalingen per minuut (1 per seconde) (dit duurt meestal <1 min). LET OP: Laat de muis niet te lang in de kamer, omdat dat kan leiden tot verstikking en de dood. Slechts één muis tegelijk onder narcose.</li>
		<li>Breng de muis op het warmtekussen op de operatietafel, plaats de muis met zijn neus in de neuskegel en behoud de verdovingstoestand met 3-4% isoflurane in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 0,5 L/min. Controleer de ademhalingssnelheid om ervoor te zorgen dat de diepte van anesthesie wordt gehandhaafd. OPMERKING: De ASSISTENT moet de ademhaling van de muis tijdens de operatie controleren om ervoor te zorgen dat het juiste niveau van anesthesie wordt gehandhaafd. Verlaag de verdovingsconcentratie als de ademhaling te langzaam wordt of verhoog de concentratie als de diepte van anesthesie te ondiep is. Als de muis begint te hijgen, verwijder de muis uit de neuskegel, verklein de verdovingsconcentratie en wacht tot de ademhaling normaliseert voordat u de neuskegel opnieuw plaatst.</li>
		<li>Voer een "pinch test" en "hoornvlies reflex test"14 om ervoor te zorgen dat de muis volledig verdoofd voordat de operatie begint. OPMERKING: Beweging van een deel van de muis is een indicatie dat de muis niet volledig verdoofd is. Het dier moet onmiddellijk extra verdoving krijgen door de verdovingsconcentratie te verhogen.</li>
		<li>Bedek de ogen van de muis met een kleine hoeveelheid oogheelkundige gel om oogdroogte te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Chirurgische ingreep (CHIRURG)<ol>
<li>Swab het chirurgische gebied 3 keer met alcoholische chloorhexidine. Met behulp van tangen en een schaar, maak een 1 cm rechte incisie langs de rugzijde, 3 mm afstand van de tumor (Figuur 3A, 3B). OPMERKING: Het standaardiseren van de incisie tot 1 cm in elke muis (met behulp van een liniaal) maakt een gelijkmatige beoordeling van wondgenezing tussen muizen mogelijk. Het lokaliseren van de incisie op 3 mm afstand van de tumor zorgt voor latere intratumorale adjuvante therapie zonder lekkage van de wond.</li>
		<li>Met behulp van pincet, weg te trekken de facia en onderhuids vetweefsel tussen de tumor en buikvlies. De onderhuidse tumor is normaal aan de huidzijde bevestigd.</li>
		<li>Open de wond door de huid voorzichtig op de tumorlagerzijde te houden met behulp van een pincet en "omkeren" de tumor, zodat deze buiten zichtbaar is(figuur 3C, 3D). OPMERKING: Het gedeelte van de tumor dat moet worden gedebulkt moet het dichtst bij de opening zijn, om voldoende huid te hebben om de wond te sluiten. Wees voorzichtig niet om de huid te snijden bij het verwijderen van de tumor.</li>
		<li>Met behulp van een schaar, snijd de tumor capsule uit de helft te verwijderen, te beginnen vanaf de basis van de tumor het dichtst bij de opening.</li>
		<li>Voor 50% debulk operatie, dwars door het midden van de tumor. Schep met gebogen tangen het gedeelte van de te verwijderen tumor op (50%); schep eventuele restanten uit het gedebulkte gebied op.</li>
		<li>Voor 75% debulk, het uitvoeren van een 50% tumor debulk als in deel 2.3.5 hierboven. Snijd vervolgens de helft van de resterende 50% van de tumor en schep 25% van de tumor, met behulp van gebogen tang zoals hierboven beschreven.</li>
	</ol></li>
	<li>Het sluiten van de chirurgische site<ol>
<li>Plaats de resterende tumor terug onder de huid, en met behulp van tangen, trek de huid flappen samen en line-up van de huid langs de wond.</li>
		<li>Houd de huid bij elkaar op 5 mm van de rand van de wond en gebruik chirurgische clips om de wond te sluiten, beginnend aan de kant die het dichtst bij de tangen ligt. Breng zoveel clips aan als nodig is om ervoor te zorgen dat er geen onderliggend weefsel wordt blootgesteld. Over het algemeen worden drie tot vier clips toegepast met 2 mm tussenruimtes tussen clips. OPMERKING: Als er geen clips goed worden toegepast, verwijdert u deze met een clipverwijderaar en vervangt u nieuwe clips.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstel van muizen (ASSISTENT)<ol>
<li>Laat de muizen herstellen door ze in de warme (37 °C) verwarmingskamer te plaatsen.</li>
		<li>Plaats de kooi van de muis op het warmtekussen. Controleer de muizen in de verwarmingskamer totdat ze hersteld zijn van de verdoving (wakker en lopend) en zet de muizen vervolgens terug in de kooi. Laat de kooi nog 10 minuten op het warmtekussen staan, totdat de muizen actiever zijn geworden.</li>
		<li>Geef de muizen nat en zacht voedsel. Controleer de muizen 1 uur na de operatie voor herstel en zorg ervoor dat clips op hun plaats blijven. Zorg ervoor dat de kooi half aan/half van het warmtekussen staat, zodat dieren de temperatuur zelf kunnen regelen terwijl ze zonder toezicht zijn.</li>
		<li>Dosis muizen met 0,1 mg/kg buprenorfine (100 μL onderhuids in de scruff van de nek), 6-8 uur na de operatie (aan het eind van de dag). Monitor muizen vroeg de volgende ochtend en doseer muizen opnieuw met 0,1 mg/kg buprenorfine (100 μL onderhuids in de scruff van de nek). Geef meer nat voedsel als dat nodig is.</li>
		<li>Monitor muizen dagelijks voor de komende zeven dagen. Clips kunnen na zeven dagen worden verwijderd met behulp van de clipverwijderaar.</li>
	</ol></li>
	<li>Adjuvante of neoadjuvante behandeling<ol>
<li>Behandel muizen peri-operatief met (neo)adjuvante therapie op een bepaald moment, afhankelijk van de behandeling van belang.</li>
		<li>Behandel bijvoorbeeld muizen met één dosis van 100 μg anti-CTLA-4 intraperitoneally (i.p.) op dag 15 na inenting, of met drie doses van 200 μg anti-PD-1 i.p. op dag 15, 17 en 19 na inenting.</li>
	</ol></li>
	<li>Experimentele controles<ol>
<li>Bij het gebruik van dit model om de effecten van ontsteking/wondgenezing te beoordelen, overweeg dan het gebruik van de volgende controlegroepen: 1) No-surgery control (behandelingen kunnen nog steeds intratumorally worden toegediend); 2) Sham chirurgie controle: Een chirurgische incisie wordt gemaakt in de huid; de tumor wordt gemanipuleerd en blootgesteld, maar er wordt geen tumorweefsel verwijderd; de wond wordt afgesloten met clips.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Orosco, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+Surgical+Margins+in+the+10+Most+Common+Solid+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5686(2018).</li>
<li>Haas, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perioperative+Management+of+Extremity+Soft+Tissue+Sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 36 (2), 118-124 (2018).</li>
<li>Brennan, M. F., Antonescu, C. R., Moraco, N., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+the+study+of+10%2C000+patients+with+soft+tissue+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from the study of 10,000 patients with soft tissue sarcoma.</a> Annals of Surgery. 260 (3), 416-421 (2014).</li>
<li>Smith, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+disease+relapse+in+primary+extremity+soft-tissue+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Patterns of disease relapse in primary extremity soft-tissue sarcoma.</a> British Journal of Surgery. 103 (11), 1487-1496 (2016).</li>
<li>Uramoto, H., Tanaka, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrence+after+surgery+in+patients+with+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Recurrence after surgery in patients with NSCLC.</a> Translational Lung Cancer Research. 3 (4), 242-249 (2014).</li>
<li>Stojadinovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+prognostic+significance+of+microscopic+margins+in+2%2C084+localized+primary+adult+soft+tissue+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas.</a> Annals of Surgery. 235 (3), 424-434 (2002).</li>
<li>Krall, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+systemic+response+to+surgery+triggers+the+outgrowth+of+distant+immune-controlled+tumors+in+mouse+models+of+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy.</a> Science Translational Medicine. 10 (436), (2018).</li>
<li>Bakos, O., Lawson, C., Rouleau, S., Tai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+surgery+and+immunotherapy%3A+turning+an+immunosuppressive+effect+into+a+therapeutic+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Combining surgery and immunotherapy: turning an immunosuppressive effect into a therapeutic opportunity.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 86(2018).</li>
<li>Predina, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+surgical+models+of+postoperative+tumor+recurrence+for+preclinical+adjuvant+therapy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of surgical models of postoperative tumor recurrence for preclinical adjuvant therapy assessment.</a> American Journal of Translational Research. 4 (2), 206-218 (2012).</li>
<li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> American Journal of Pathology. 170 (3), 793-804 (2007).</li>
<li>Khong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+tumor+debulking+surgery+is+improved+by+adjuvant+immunotherapy+using+imiquimod+and+anti-CD40%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The efficacy of tumor debulking surgery is improved by adjuvant immunotherapy using imiquimod and anti-CD40.</a> BMC Cancer. 14, 969(2014).</li>
<li>Broomfield, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial%2C+but+not+complete%2C+tumor-debulking+surgery+promotes+protective+antitumor+memory+when+combined+with+chemotherapy+and+adjuvant+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Partial, but not complete, tumor-debulking surgery promotes protective antitumor memory when combined with chemotherapy and adjuvant immunotherapy.</a> Cancer Research. 65 (17), 7580-7584 (2005).</li>
<li>Predina, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive-margin+resection+model+recreates+the+postsurgical+tumor+microenvironment+and+is+a+reliable+model+for+adjuvant+therapy+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">A positive-margin resection model recreates the postsurgical tumor microenvironment and is a reliable model for adjuvant therapy evaluation.</a> Cancer Biology & Therapy. 13 (9), 745-755 (2012).</li>
<li>Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+signs+monitoring+during+injectable+and+inhalant+anesthesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice.</a> Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).</li>
<li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOverwijk%2C+WW+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , Chapter 20, Unit 20-21 (2001).</li>
<li>Predina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+local+tumor+microenvironment+in+recurrent+cancers+may+explain+the+failure+of+vaccines+after+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Changes in the local tumor microenvironment in recurrent cancers may explain the failure of vaccines after surgery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (5), E415-E424 (2013).</li>
<li>Endo, M., Lin, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+margins+in+the+management+of+extremity+soft+tissue+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Surgical margins in the management of extremity soft tissue sarcoma.</a> Chinese Clinical Oncology. 7 (4), 37(2018).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Efficacy+of+Neoadjuvant+Compared+to+Adjuvant+Immunotherapy+to+Eradicate+Metastatic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Improved Efficacy of Neoadjuvant Compared to Adjuvant Immunotherapy to Eradicate Metastatic Disease.</a> Cancer Discovery. 6 (12), 1382-1399 (2016).</li>
<li>Park, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+release+of+perioperative+immunotherapy+prevents+tumor+recurrence+and+eliminates+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extended release of perioperative immunotherapy prevents tumor recurrence and eliminates metastases.</a> Science Translational Medicine. 10 (433), (2018).</li>
<li>Tai, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+tumor+model+of+surgical+stress+to+explore+the+mechanisms+of+postoperative+immunosuppression+and+evaluate+novel+perioperative+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51253(2014).</li>
<li>Gast, C. E., Shaw, A. K., Wong, M. H., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+Procedures+and+Methodology+for+a+Preclinical+Murine+Model+of+De+Novo+Mammary+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li>
<li>Qiu, W., Su, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+orthotopic+pancreatic+tumor+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).</li>
<li>Erstad, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+and+heterotopic+murine+models+of+pancreatic+cancer+and+their+different+responses+to+FOLFIRINOX+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).</li>
</ol>

Geen onthullingen.

Wij bieden een protocol voor een muismodel van onvolledige chirurgische resectie van weke delen sarcoom om peri-operatieve therapieën te testen. We hebben ook gestandaardiseerd de chirurgische incisie om beoordeling van wondgenezing tussen muizen na de behandeling mogelijk te maken.
Tumor plaatsing is een belangrijk onderdeel van dit protocol. We hebben gekozen voor een onderhuids tumormodel om gemakkelijke chirurgische toegang tot de tumorsite en toediening van lokale therapieën mogelijk te m...

Chirurgie blijft de belangrijkste behandelingsoptie voor veel vaste tumoren1, waaronder weke delen sarcoom2,3. Ondanks verbeteringen in kankerchirurgietechnieken en combinaties met (neo)adjuvante therapieën, is er nog steeds een hoog risico op kankerreval en metastase na primaire tumorresectie4,5. In weke delen sarcoom, recidieven optreden bijzonder locoregionaal, op de plaats van de operatie, wat resulteert in een verhoogde morbiditeit en mortaliteit. In de klinische setting kan het moeilijk zijn om ruim genoeg marges te verkrijgen (bijvoorbeeld vanwege anatomische beperkingen), wat resulteert in onvolledige resectie en daaropvolgende tumorrecidief6. Chirurgische stress en het daaropvolgende proces van wondgenezing zijn bekend om een immunosuppressieve tumor micro-omgeving gunstig voor tumor recidief7,8te creëren. Daarom moet de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe therapieën voor weke delen sarcoom, met name immunotherapieën, idealiter rekening houden met de chirurgische wondgenezingsrespons.
De meeste preklinische studies voor adjuvante therapieën worden in eerste instantie uitgevoerd met behulp van onderhuidse syngenetische of xenotransplantatie muismodellen, zonder integratie van de chirurgische stress en wondgenezing respons9,10. Daarom ontwikkelden we een syngeneic onderhuids muiskecotweefsel sarcoom model waarin onvolledige chirurgische resectie. WEHI 164 fibrosarcoomcellen worden onderhuids ingeënt, en zodra tumoren zijn vastgesteld, verwijderen we 50-75% van de tumorbulk(figuur 1A-E). Tumoren consequent opnieuw groeien van de resterende tumor. Dit model maakt het mogelijk voor het testen van adjuvante therapieën, terwijl rekening houdend met het effect van chirurgische stress en wondgenezing. Soortgelijke chirurgische modellen van onvolledige resectie zijn in een aantal studies door verschillende groepen gebruikt en reproduceerbaar en effectiefbevonden 11,12,13. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van dit protocol.

<table><tbody><tr><td>26 gauge 0.5 mL insulin syringe</td><td>Becton Dickinson, Australia</td><td>326769</td><td>None</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>21985023</td><td>None</td></tr><tr><td>Anaestetic gas machine</td><td>Darvall Vet, Australia</td><td>SKU: 2848</td><td>None</td></tr><tr><td>Anti-CTLA-4</td><td>BioXcell, USA</td><td>BE0164</td><td>None</td></tr><tr><td>Anti-PD-1</td><td>BioXcell, USA</td><td>BP0273</td><td>None</td></tr><tr><td>Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL</td><td>RB healthcare UK Limited, UK</td><td>55175</td><td>Prescription order</td></tr><tr><td>Chlorhexidine Surgical Scrub 4%</td><td>Perigo Australia, Australia</td><td>CHL01449F(scrub</td><td>None</td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>CellSera, Australia</td><td>AU-FBS-PG</td><td>None</td></tr><tr><td>Forceps Fine 10.5 cm</td><td>Surgical house, Western Australia</td><td>CC74110</td><td>None</td></tr><tr><td>Forceps Fine 12 cm Serrated</td><td>Surgical house, Western Australia</td><td>CC74212</td><td>None</td></tr><tr><td>Forceps Halsted 14 cm</td><td>Surgical house, Western Australia</td><td>CD01114</td><td>None</td></tr><tr><td>Heating chamber</td><td>Datesand Ltd, UK</td><td>Mini-Thermacage</td><td>None</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>15630080</td><td>None</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein Animal Health, Australia</td><td>SKU: 29405</td><td>Prescription order</td></tr><tr><td>Lubricating Eye Ointment</td><td>Alcon</td><td>n/a</td><td>None</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin 1000X</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>15140122</td><td>None</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Solution 10x</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>70013-032</td><td>None</td></tr><tr><td>Reflex 7mm Clips</td><td>Able scientific, Australia</td><td>AS59038</td><td>None</td></tr><tr><td>Reflex 7mm Wound Clip Applicator</td><td>Able scientific, Australia</td><td>AS59036</td><td>None</td></tr><tr><td>Reflex Wound Clip Remover</td><td>Able scientific, Australia</td><td>AS59037</td><td>None</td></tr><tr><td>Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit</td><td>Darvall Vet, Australia</td><td>#7885</td><td>None</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>21870092</td><td>None</td></tr><tr><td>Scissors Iris STR 11 cm</td><td>Surgical house, Western Australia</td><td>KF3211</td><td>None</td></tr><tr><td>Scissors Iris STR 9 cm</td><td>Surgical house, Western Australia</td><td>JH4209</td><td>None</td></tr><tr><td>Small Induction Chamber</td><td>Darvall Vet, Australia</td><td>SKU: 9630</td><td>None</td></tr><tr><td>TrypLE express 1x</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>12604-021</td><td>None</td></tr><tr><td>Germinator 500 Glass Bead Sterilizer</td><td>Cellpoint Scientific Inc., USA</td><td>5-1460-DK</td><td></td></tr></tbody></table>

een muismodel van onvolledig gereseceerde weke delen sarcoom voor het testen van (neo)adjuvante therapieën

A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvant Therapies

Chirurgie is vaak de eerste behandeling voor veel vaste tumoren. Echter, lokale recidieven optreden vaak na primaire tumor resectie, ondanks adjuvante of neo-adjuvante therapieën. Dit gebeurt wanneer chirurgische marges onvoldoende tumorvrij zijn, wat resulteert in resterende kankercellen. Vanuit biologisch en immunologisch perspectief is chirurgie geen nulgebeurtenis; de wondhelende omgeving is bekend dat zowel pro- als anti-tumorigenische paden induceren. Als gevolg hiervan moeten preklinische modellen voor medicijnontwikkeling die gericht zijn op het voorkomen van lokale terugval chirurgische resectie bevatten bij het testen van nieuwe (neo)adjuvante therapieën, om de klinische instellingen te modelleren bij patiënten die met een operatie worden behandeld.
Hier beschrijven we een muismodel van onvolledige chirurgische resectie van WEHI 164 weke delen sarcoom waarmee (neo)adjuvante therapieën kunnen worden getest in de setting van een wondgenezingsrespons. In dit model wordt 50% of 75% van de tumor verwijderd, waardoor er in situ wat kankerweefsel achterblijft om een bruto restziekte te modelleren na een operatie in de klinische setting. Dit model maakt het mogelijk om therapieën te testen in de context van een operatie, terwijl ook rekening wordt gehouden met de wondgenezingsrespons, die de werkzaamheid van (neo)adjuvante behandelingen kan beïnvloeden. De onvolledige chirurgische resectie resulteert in reproduceerbare hergroei van de tumor bij alle muizen bij afwezigheid van adjuvante therapie. Adjuvante behandeling met checkpoint blokkade resulteert in verminderde tumor hergroei. Dit model is dus geschikt voor het testen van therapieën in het kader van debulking chirurgie en de bijbehorende wondgenezing reactie en kan worden uitgebreid tot andere vormen van vaste kanker.

Tumorgroei tot een grootte van 50 mm2 is een ideale grootte voor gedeeltelijke debulk. De onvolledige chirurgische resectie van 50 mm2 tumoren resulteert in 100% (n=5) reproduceerbare hergroei van de tumoren bij afwezigheid van adjuvante immunotherapie (figuur 4A). Vervolgens gebruikten we het model om adjuvante immunotherapieën te testen met behulp van antilichamen tegen checkpointmoleculen Cytotoxisch T Lymphocyte Asso...

In dit protocol beschrijven we een muismodel van onvolledige chirurgische resectie van weke delen sarcoom voor het testen van (neo)adjuvante therapieën.

Een muismodel van onvolledig gereseceerde weke delen Sarcoom voor het testen van (Neo)adjuvante therapieën

Surgery is often the first treatment for many solid tumors. However, local relapses frequently occur following primary tumor resection, despite adjuvant ...

Dit protocol is bedoeld om de klinische setting van restziekte na te bootsen na tumordebulking chirurgie, en stelt ons daarom in staat om nieuwe kankertherapieën te testen in het kader van postoperatieve wondgenezing. Het voordeel van deze techniek is dat het standaardisatie van de hoeveelheid toegebrachte wond en de hoeveelheid tumor toestaat om te blijven. Deze techniek is vooral belangrijk voor preklinische studies in die identificatie van nieuwe behandelingen voor kanker, dat het lokaal een voorbeeld van is weke delen sarcoom.Deze visuele demonstratie is van cruciaal belang om de inversietechniek aan te tonen, waardoor we de tumor aan de huidkant kunnen blootstellen. Begin deze procedure met de onderhuidse inenting van voorbereide kankercellen bij muizen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Op dag 12, post-inenting, wanneer tumoren een grootte van ongeveer 50 vierkante millimeter hebben bereikt, dosis muizen met 100 microliter buprenorfine onderhuids in de scruff van de nek, 30 minuten voor de operatie.Zet het chirurgische gebied met het warmtekussen bedekt met banklaag en zet een neuskegel op voor anesthesie. Schik schone chirurgische apparatuur, zodat ze binnen handbereik, met inbegrip van chlorhexadine, wattenstaafje, gaas, ooggel, twee gebogen tangen, schaar, clip applicator, clip remover, en clip vullingen. Verwarm de verwarmingskamer tot 37 graden Celsius en zet een ander warmtekussen op voor herstel.Houd er rekening mee dat deze procedure twee personen vereist. Een assistent moet de ademhaling van de muis tijdens de procedure nauwlettend in de gaten houden. Na het verdoven van de muis zoals beschreven in het tekstprotocol, voert u een pinch-test en hoornvliesreflextest uit om ervoor te zorgen dat de muis volledig verdoofd is voordat u met een operatie begint.Bedek de ogen van de muis met een kleine hoeveelheid oogheelkundige gel om oogdroogte te voorkomen. Begin deze operatie door het chirurgische gebied te laten uitstrijkjes met chlorhexadine. Met behulp van tangen en een schaar maken een een centimeter rechte incisie langs de rugkant, drie millimeter afstand van de tumor.Snijd de huid niet rechtstreeks die de tumor bedekt, omdat deze niet goed geneest. Vermijd het gebruik van een scalpel om de tumor te snijden en gebruik pincet om de stukken te scheppen. Met behulp van pincet, weg te trekken de fascia en onderhuids vetweefsel tussen de tumor en buikvlies.De onderhuidse tumor is normaal bevestigd aan de huidzijde. Open de wond door de huid voorzichtig op de tumorlagerkant te houden met behulp van een pincet en de tumor om te keren, zodat deze buiten zichtbaar is. Met behulp van een schaar, snijd de tumor capsule uit de helft te verwijderen, te beginnen vanaf de basis van de tumor het dichtst bij de opening.Voor 50% debulk operatie, dwars door het midden van de tumor. Met behulp van gebogen tang schep het gedeelte van de tumor te verwijderen. Schep alle restanten uit het debulkgebied op.Voor 75% debulk, beginnen met het uitvoeren van een 50%tumor debulk dan gesneden in de helft van de resterende 50% van de tumor. Schep 25% van de tumor op met gebogen tangen. Om de chirurgische site te sluiten, plaats de resterende tumor terug onder de huid en met behulp van tangen, trek de huid flappen samen en line-up van de huid langs de wond.Houd de huid vijf millimeter van de rand van de wond bij elkaar en gebruik chirurgische clips om de wond te sluiten die aan de zijkant begint, het dichtst bij de tangen. Breng zoveel clips aan als nodig is om ervoor te zorgen dat er geen onderliggend weefsel wordt blootgesteld. Over het algemeen worden drie tot vier clips toegepast met twee millimeter tussen de clips.Laat de muizen herstellen door ze in de warme verwarmingskamer te plaatsen. Plaats de kooi van de muis op het warmtekussen. Controleer de muizen in de verwarmingskamer totdat ze hersteld zijn van de verdoving.Zet vervolgens de muizen terug in de kooi, laat de kooi nog 10 minuten op het heatpad staan totdat de muizen actiever zijn geworden. Geef de muizen nat en zacht voedsel. Controleer de muizen een uur na de operatie voor herstel.Controleer de muizen aan het eind van de dag en de volgende ochtend opnieuw en zorg ervoor dat de clips op hun plaats blijven. Behandel muizen perioperitief met advent of neoadjuvante therapie op een bepaald moment, afhankelijk van de behandeling van belang. Behandel bijvoorbeeld muizen met één dosis van 100 microgram anti-CTLA-4 intraperitoneally op dag 15 na inenting.U de muizen ook behandelen met drie doses van 200 microgram anti-PD-1 intraperitoneally op dagen, 15, 17 en 19 na inenting. De onvolledige chirurgische resectie van 50 vierkante millimeter tumoren, hier aangegeven door de stippellijn resulteert in 100% reproduceerbare hergroei van de tumoren bij afwezigheid van adjuvante immunotherapie. Daarom is tumorgroei tot een grootte van 50 vierkante millimeter een ideale grootte voor gedeeltelijke debulk.Het model werd vervolgens gebruikt om adjuvante immunotherapieën te testen met behulp van antilichamen tegen checkpointmodules, cytoxisch T-lymfatisch geassocieerd eiwit vier en geprogrammeerde doodsreceptor één. Behandeling van muizen met anti-CTLA-4, resulteerde in een genezingspercentage van 80%, Terwijl de behandeling van muizen met anti-PD-1 resulteerde in een genezingspercentage van 25%De respons met anti-PD-1 biedt een kans om nieuwe combinaties te testen, om de respons verder te verbeteren. Het is belangrijk dat de resterende tumor aan de huid blijft vastzitten, anders wordt de bloedtoevoer afgesneden en wordt de tumor de necrotische.Na deze procedure kunnen tumoren worden geanalyseerd door verschillende methoden, zoals stroomcytometrie om te beoordelen hoe chirurgie tumorinfiltrerende cellen beïnvloedt. Dit muismodel heeft ons in staat gesteld om te onderzoeken hoe wondgenezing gevolgen heeft voor kankerimmunotherapieën.

a-mouse-model-incompletely-resected-soft-tissue-sarcoma-for-testing

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes the protocol to establish a spontaneous metastasis mouse model of colorectal cancer patient-derived xenografts or PDXs. These xenograft models partially mimic the features of human carcinomas and understand the critical aspects of human malignancies, including invasion and metastasis.

Spontaneous Metastasis Mouse Models: A Platform to Study the Metastatic Potential of Orthotopically Injected Colorectal Cancer Cells

This video illustrates testing of adjuvant or additional therapy in a mouse model with incompletely resected subcutaneous tumors. The partially tumor-resected mouse is treated with an antibody targeting the anti-cytotoxic protein of T regulatory cells, potentially reducing tumor regrowth and suggesting effective adjuvant therapy.

An Adjuvant Therapy in a Mouse Model with an Incompletely Resected Subcutaneous Tumor

Source: Alomari, S., et al. Implementation of Minimally Invasive Brain Tumor Resection in Rodents for High Viability Tissue Collection. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the use of a minimally invasive resection system (MIRS) to excise tumor tissue from an anesthetized mouse implanted with a tumor. The procedure involves securing the mouse onto a stereotactic frame, reopening the previous surgical site to access the brain, and inserting a specialized cannula that utilizes suction and a...

Brain Tumor Resection in a Mouse Using a Minimally Invasive Resection System

Een muis tumor model van chirurgische spanning wordt gebruikt om te onderzoeken hoe postoperatieve onderdrukking van het immuunsysteem bevordert gemetastaseerde ziekte en immuunstimulerende perioperatieve therapie te evalueren.

Een muis Tumor Model of Surgical Stress aan Ontdek de Mechanismen van Postoperatieve Immuunsuppressie en evalueren Novel Perioperative Immuuntherapie

Modellen van spontane gemetastaseerd niercelcarcinoom (RCC) ziekteprogressie kan worden gebruikt voor het evalueren behandelingen klinisch relevante omgeving. Dit protocol toont verschillende procedures voor orthotopic nier tumorcelimplantatie, goede nefrectomie, en ten slotte schetst een necropsy gids voor visuele en bioluminescente scoren van metastatische last en lokalisatie.

Modelleren Spontane gemetastaseerd niercelcarcinoom (mRCC) bij muizen na nefrectomie

Een orthotope borstkanker primaire tumor model en chirurgische verwijdering van de primaire tumor de muis het leven uit te breiden tot spontane metastase genereren beschreven. De tumorgroei en progressie worden gecontroleerd en gekwantificeerd luciferase fluorescentiebeeldvorming.

Een orthotope Muis Model van Spontane uitzaaiing van borstkanker

Preklinische modellen die adjuvante therapie beoordelen die gericht zijn op metastase van borstkanker, ontbreken. Om dit aan te pakken, ontwikkelden we een muizenmodel van de novo pulmonale mammary adenocarcinoma metastase, waarbij therapieën toegediend in de adjuvante omgeving (post-chirurgische resectie van primaire tumoren) kunnen worden geëvalueerd voor werkzaamheid bij het beïnvloeden van eerder gecoede pulmonale metastasen.

Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van De Novo Maagkanker Metastase

Implementatie van een orthotope model niercelcarcinoom in immunocompetente muizen levert de onderzoeker een klinisch relevante systeem gedefinieerd door de aanwezigheid van een primaire niertumor en longmetastasen in hetzelfde dier. Dit systeem kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan behandelingen in vivo preklinisch testen.

Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën

Directe inspuiting van kanker afkomstige extracellulaire blaasjes (EVs) leidt tot een herprogrammering van beenmerg, ter ondersteuning van de progressie van de tumor; het is echter onduidelijk welke cellen bemiddelen dit effect. Hierin beschrijven we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken EV-gemedieerde tumor-mesenchymale stamcellen (MSC) interacties in vivo, onthullen een cruciale rol voor EV-opgeleide MSCs in metastase.

Een preklinische muismodel van osteosarcoom definiëren de extracellulaire vesikel-gemedieerde communicatie tussen Tumor en mesenchymale stamcellen

In de klinische context zullen patiënten met gelokaliseerde alvleesklierkanker pancreatectomie ondergaan, gevolgd door adjuvante behandeling. Dit hier gerapporteerde protocol is bedoeld om een veilige en effectieve methode vast te stellen om dit klinische scenario bij naakte muizen te modelleren, door orthotopische implantatie van alvleesklierkanker gevolgd door distale pancreatectomie en splenectomie.

Een orthotopisch resectiemuismodel van alvleesklierkanker

Een unieke methode om chirurgisch orale plaveiselceltumoren die in de mondholte zijn gevestigd, te verwijderen, wordt hier getoond.

Translationeel relevant tumorresectiemodel voor muispreklinische modellen van orale plaveiselcelcarcinoom

Leer een muismodel van onvolledig gereseceerde weke delen sarcoom voor het testen van (neo)adjuvante therapieën. Deze methode standaardiseert residuale tumor en wondheling voor preklinisch onderzoek.

Een muismodel van onvolledig gereseceerde weke delen Sarcoom voor het testen van (Neo)adjuvante therapieën

Meer video's verkennen