Montage en karakterisering van Polyelectrolyte Complex Micelles

Deze methode beschrijft het volledige pad van het ontwerp, de assemblage en de karakterisering van polyelectrolyt complexe micelles die nanodeeltjes zijn die worden gevormd uit de zelfassemblage van tegenovergesteld geladen polymeren. Enkele grote uitdagingen met polyelectrolyt zelfassemblage zijn het vermijden van kinetische vallen en het karakteriseren van de nanodeeltjes. De zout annealing techniek die we beschrijven zorgt voor de herhaalbare assemblage van micelles met een lage spreiding in zowel grootte en vorm en we beschrijven karakterisering methoden met inbegrip van licht verstrooiing, kleine hoek x-ray verstrooiing, en elektronenmicroscopie.

Het leveren van therapeutische nucleïnezuren is een langdurige uitdaging voor nanogeneeskunde. Deze polyelectrolyt complexe micelles profiteren van de sterke negatieve lading van het nucleïnezuur om ze af te nemen in de kern van de micelle waar de neutrale polymeer corona hen beschermt tegen nucleases en immuunrespons. De montagemethode moet van toepassing zijn op elk type geladen polymeren.

We hebben ze getest met verschillende polyanionen en polycaties en de karakteriseringsmethode moet van toepassing zijn op alle zelf geassembleerde nanodeeltjes, waaronder oppervlakteactieve nanodeeltjes en andere hydrofoobisch aangedreven systemen. Begin met het uitbroeden van de oligonucleotide oplossing bij 70 graden Celsius gedurende vijf minuten. Na de incubatie, koel het gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om thermisch anneal de nucleïnezuren, voeg vervolgens 40 microliters van 20 millimolar geladen concentratie diblock copolymeer.

Vortex de oplossing onmiddellijk en incubeer het gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Om het zout anneal uit te voeren, voeg natriumchloride oplossing aan de oligonucleotide oplossing voor een laatste concentratie van een kies en vortex gedurende 10 seconden op maximale snelheid. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en ga vervolgens verder met het laden in de dialysecartridge.

Voorafgaand aan het laden, label cartridges met permanente marker en laat ze in buffer gedurende ten minste twee minuten om de membranen hydrateren. Verwijder de dop door tegen de klok in te draaien en laad het monster met behulp van een gel laden pipet tip. Knijp voorzichtig in het membraan om overtollige lucht te verwijderen en vervang de dop.

Doe de cartridges in 1X PBS 0,5 molaire natriumchloride dialyse bad ervoor te zorgen dat ze drijven met beide membranen blootgesteld aan het bad. Breng de cartridges na 24 uur over in 1X PBS en laat het 24 uur extra weken. Na de laatste dialyse u het monster herstellen door de cartridges uit het bad te verwijderen, de dop te verwijderen en het monster te verwijderen met een gelladenpipetpunt.

Doe het monster in een schone microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en koel het tot het gebruiksklaar is. Bereid het monster in DLS-instrument volgens manuscriptaanwijzingen en verwerf vervolgens gegevens gedurende ten minste één minuut om ervoor te zorgen dat het telpercentage constant is gedurende de gehele acquisitietijd. Controleer de gegevens over autocorrelatie.

De lange tijd baseline moet vlak zijn en de autocorrelatie curve moet glad zijn met minimale spreiding. Ruis in de gegevens kan worden verbeterd door het verwerven van meer gegevens. Om gegevensreductie en -analyse uit te voeren met Irena, moet u beginnen met het importeren van micelle in achtergrondgegevenssets.

Plot het voorbeeld en de achtergrond samen op een logboekschaal en berekent de verhouding tussen voorbeeld en achtergrond en controleer de hoge Q-asymptote. Bereken de gemiddelde verhouding over dit Q-bereik en gebruik de macro voor gegevensmanipulatie om de achtergrond te schalen met de berekende verhouding. Plot vervolgens het afgetrokken signaal op de achtergrond boven Q en sla de gegevens op met een nieuwe naam, zodat u ervoor zorgt dat de oorspronkelijke gegevens niet worden overschreven.

Open de modelleringsmacro en laad en plot de afgetrokken gegevens op de achtergrond. Als u een bij benadering model wilt vinden voor het externe oppervlak van de polyelectrolyte complexe micelle of PCM, selecteert u stroom naar matige Q-bereik in de gegevensbesturingselementen, zodat u schommelingen wilt opnemen als deze aanwezig zijn. Selecteer in modelbesturingselementen de eerste verstrooiingspopulatie en zorg ervoor dat deze de enige is die wordt gebruikt.

Selecteer grootteverdeling voor model, kies het gewenste distributietype en selecteer de formulierfactor. Dit voorbeeld is voor een flexibele cilinder die handmatig moet worden toegevoegd onder de gebruikersvormfactor. Download en voeg de flexibele cilindervormfactor toe en voer vervolgens de functienamen en de initiële waarden in voor parameters één en twee die overeenkomen met de lengte van de cilinder en de Kuhn-lengte.

Deze cilinders zijn langer dan kan worden opgelost door SAXS, zodat de cilinder lengte parameter is vastgesteld op een grote waarde. Stel de eerste parameters voor het zoeken in door waarden in te voeren in de schaal-, gemiddelde grootte- en breedtevelden. Klik vervolgens op model berekenen om de resulterende vormfactor te tekenen.

Zodra redelijke parameters zijn gevonden, klikt u op fit model om een niet-lineaire minst vierkanten uit te voeren die passen bij de gegevens. Modelleer vervolgens de verstrooiing van de afzonderlijke polymeren in de PCM-kern. Pas de gegevensbesturingselementen aan om het Q-bereik te selecteren waar overmatige spreiding optreedt die meestal in het matige tot hoge bereik is.

Voeg een tweede verstrooiende populatie toe en zorg ervoor dat dit de enige is die in gebruik is. Selecteer een uniform niveau voor het model, pas de GDA-factoren G en RG aan om ervoor te zorgen dat het model geen overmatige verstrooiing bij lage Q voorspelt en gebruik de geschikte PB tussen cursors macro om een eerste schatting voor deze parameters te verkrijgen. Wat betreft de form factor, voer een niet-lineaire pasvorm voor het uniforme niveau model.

Als er een diffractiepiek aanwezig is, voeg dan een derde model toe voor de diffractiepiek in het Q-bereik van belang. Zodra benaderende fit waarden zijn verkregen voor de individuele verstrooiingspopulaties, schakel u alle drie samen in en optimaliseert u de gecombineerde pasvorm. Controleer ten slotte of elke waarde fysiek redelijk blijft en sla de pasvorm op door winkel in map te selecteren.

Het resultaat van deze procedure moet een samengesteld model zijn dat de kleine hoek x-ray verstrooiingsgegevens over een groot aantal grootteschalen beschrijft. Dit protocol werd gebruikt voor het ontwerpen, monteren en karakteriseren van nucleïnezuur polyelectrolyte complexe micelles of PCMs. Micelle kerngrootte wordt voornamelijk gedreven door de lengte van het geladen blok van het blok copolymeer en is grotendeels onafhankelijk van de lengte van het homopolymeer.

Dynamische lichtverstrooiingsgegevens werden verkregen voor bolvormige PCM's gevormd uit relatief lange blokcopolymeren in korte enkelstrengs oligonucleotiden. De autocorrelatiefunctie is vervallen tot een vlakke waarde met de enkele tijdschaal, wat resulteert in de enkele groottepiek in de respuitingsgrootteverdeling. Complexe kleine engel x-ray verstrooiing of SAXS intensiteit spectra kan nauwkeurig worden aangepast door het combineren van modellen voor de meerdere ruimtelijke correlaties die aanwezig zijn en multiangle lichtverstrooiing kan worden gebruikt om verstrooiingsmetingen uit te breiden tot langere lengte schalen.

PCM's van verschillende morfologie kunnen ook worden afgebeeld met elektronenmicroscopie om te controleren of kernstralen en -vorm in overeenstemming zijn met de waarden die worden verkregen uit het monteren van SAXS-gegevens. Bij het aanpassen van SAXS-gegevens is het belangrijk om rekening te houden met elke verstrooiingsfunctie en om gratis methoden zoals TEM te gebruiken om ervoor te zorgen dat u de juiste vormfactor gebruikt.