Geleid Assemblage van Elastin-achtige eiwitten in gedefinieerde supramoleculaire structuren en cargo-encapsulation in vitro

De efficiënte assemblage van supramoleculaire structuren voor minimaal celontwerp en medicijnlevering blijft een uitdaging. Hier demonstreren we efficiënte protocollen die supramoleculaire structuren opleveren op basis van amphifiele elastine-achtige eiwitten. De gepresenteerde assemblageprotocollen genereren veelzijdige supramoleculaire structuren met aanpasbare fysisch-chemische eigenschappen, zoals vesicles, vezels en coacervates.

Eiwitmembraan-gebaseerde compartimenten tonen fasescheiding gedrag en zorgen voor de inkapseling van chemisch diverse fluorescerende lading moleculen. Voor expressie van F20E20-mEGFP en F20E20-mCherry, inenten de belangrijkste expressie cultuur van de 's nachts pre-cultuur tot een OD600 van 0,3. Incubeer het in 400 milliliter steriel LB medium aangevuld met geschikte antibiotica bij 37 graden Celsius en 200 rpm.

Wanneer de expressiecultuur OD600 van 0,5 tot 0,8 bereikt, voegt u IPTG toe aan een laatste concentratie van één millimolar en verlaagt u de incubatietemperatuur tot 20 graden Celsius. Voor expressie van amphifiele ELP met het onnatuurlijke aminozuur, inent de belangrijkste expressiecultuur van 's nachts E.coli pre-cultuur met de juiste plasmiden tot een OD van 0,3. Incubeer het in 400 milliliter steriel LB medium aangevuld met kanamycine en chloramphenicol bij 37 graden Celsius en 200 rpm.

Ter voorbereiding van de 100-millimolar onnatuurlijke aminozuur voorraad, voeg 206,2 milligram onnatuurlijk aminozuur aan acht milliliter ultrazuiver water. Verhoog de pH van de oplossing met natriumhydroxide van drie kiezen en meng krachtig. Wanneer het onnatuurlijke aminozuur is opgelost, verlaagt u de pH tot ongeveer 10,5 en voegt u ultrazuiver water toe aan een volume van 10 milliliter.

Filter de oplossing met een steriel filter van 0,22 micrometer en filtreer deze in twee milliliter reactiebuizen. Wanneer de expressiecultuur OD600 van 0,5 tot 0,8 bereikt, voegt u het onnatuurlijke aminozuur toe aan een uiteindelijke concentratie van twee millimolar. Incubeer het nog 10 minuten.

Dan induceren expressie van het doel eiwit en de nodige tRNA synthetase via gelijktijdige toevoeging van IPTG en arabinose. Verlaag de incubatietemperatuur tot 20 graden Celsius en laat de expressie ongeveer 20 uur aanhouden. Na de incubatie, oogst de cellen door centrifugatie op vier graden Celsius en 4,000 keer g gedurende 40 minuten.

Resuspend de celpellet in lyse buffer met lysozyme en PMSF. Broed de oplossing gedurende 30 minuten op ijs. Vries dan in en ontdooi het twee keer door onder te dompelen in vloeibare stikstof.

Sonicate de schorsing, en duidelijk de lysaat door centrifugatie op 10, 000 keer g en vier graden Celsius gedurende 40 minuten. Zuiver vervolgens het eiwit met behulp van affiniteitschromatografie. Na eiwit elutie, bewaar het op vier graden Celsius tot verder gebruik.

Voeg een microliter van fluorescerende kleurstof tot 500 microliter van ELP-oplossing, en broeden de reactie voor ongeveer 10 uur op 15 graden Celsius tijdens het schudden in een ThermoMixer, zorg ervoor dat het te beschermen tegen licht. Om overmatige fluorescerende kleurstof te verwijderen, moet u een dialysemembraan in ultrazuiver water gedurende 10 minuten in evenwicht brengen. Snijd het membraan in de juiste maat om bovenop de opening van de reactiebuis te worden geplaatst met de geklikte ELP-oplossing.

Bevestig vervolgens het membraan aan de opening door de buis te sluiten met een deksel dat geen kern heeft. Vul de ruimte tussen deksel en membraan met buffer om het vangen van lucht te voorkomen. Plaats vervolgens de reactiebuis in de gekozen buffer, duw deze onder het oppervlak en draai deze ondersteboven.

Voer dialyse uit gedurende ten minste drie uur bij vier graden Celsius, waardoor de dialyse nog minstens drie uur na elke bufferwijziging kan worden voortgezet. Bij zwelling van THF dialyseert u de homogene ELP-oplossing tegen fosfaat of Tris-buffer met stabiele pH 7,5. Bereid de lyofilier en laat deze afkoelen tot starttemperatuur voor vriesdrogen.

Aliquot de gedialyseerde eiwitoplossing in 1,5 milliliter reactiebuizen en verzegel met doppen met een klein gaatje om te voorkomen dat het vaste monster verloren gaat door drukveranderingen in de loop van het vriesdrogen. Schokbevriezing van de monsters in vloeibare stikstof. Neem de bevroren eiwitmonsters uit de vloeibare stikstof en plaats ze onmiddellijk in de lyofielieer om te beginnen met vriesdrogen.

Nadat het monster volledig droog is, ventileren met droge stikstof, en sluit onmiddellijk de reactie buis deksels om contact met luchtvocht te voorkomen. Voeg pure THF toe aan de gelyofiele monsters en plaats de oplossing 15 minuten in een waterbad met ijswater. Verwarm een thermocycler voor op 30 tot 60 graden Celsius voor blaasvorming of tot 90 graden Celsius voor vezelvorming, en bereid nieuwe reactiebuizen voor met ultrazuiver water of buffer.

Na de sonicatie plaatst u de ELP/THF-oplossing en het bereide water of buffer gedurende vijf minuten in de thermocycler. Stratify de ELP-oplossing op de top van het water of buffer, ervoor te zorgen dat de scheiding van de twee fasen en een duidelijke interfase zichtbaar is, en plaats het mengsel terug in de thermocycler. Laat het monster 10 minuten afkoelen bij kamertemperatuur en ga verder met dialyse tegen water of buffer of met fluorescentiemicroscopie.

Bereid een elp-oplossing van één tot 50 micromolar voor en voeg 10 tot 20% 1-butanol toe. Meng de oplossing onmiddellijk door op en neer te pipetten. De troebelheid van de oplossing moet toenemen tijdens het mengen, wat wijst op blaasvorming.

Om een smalle grootteverdeling te bereiken, extrudeer je akeltjes met een mini-extruder door een membraan met een poriegrootte van één micrometer. Voor kleurstof inkapseling, meng ongeveer 40 microliter elp-oplossing in 10-millimolar Tris-HCl met een microliter van Dextran Texas Red voorraad oplossing in DMSO. Voeg 10 microliter 1-butanol toe en extrudeer vijf tot tien keer door een spuit uitgerust met een naald van 0,25 bij 25 millimeter.

De THF zwellingsmethode bestaat uit drie opeenvolgende stappen en resulteert in verschillende supramoleculaire samenstellingen van de ELP, afhankelijk van de temperatuur. De epifluorescentiemicroscopie beelden tonen vesicles samengesteld uit BDP-R20F20 en fibrillaire structuren geassembleerd uit BDP-R40F20. De 1-butanol extrusie methode leidt uitsluitend tot de vorming van ELP-eitjes.

Ongeveer twee ordes van grootte meer agelsjes worden geproduceerd in vergelijking met de THF zwelling methode. BDP-R40F20 werd gemengd met 10 tot 15%butanol, en de vikjes werden bereid via extrusie van het mengsel. Verschillende supramoleculaire structuren werden geassembleerd van BDP-R40F20 via het THF zwellingsprotocol.

De pH van de buffer en de temperatuur van het assemblageproces werden aangepast om coacervates, fibrils of vesikels te vormen. Kleine fouten in het montageprotocol kunnen leiden tot de vorming van aggregaten. Positief geladen kleurstof ATTO Rho 13 en de polysaccharide dextran rode 3000 werden ingekapseld in het lumen van vesicles geassembleerd uit F20R20-mEGFP via de 1-butanol extrusie methode.

Confocale microscopie beelden tonen de vesicles in het groene kanaal, de lading in het rode kanaal, en de succesvolle inkapseling in de resulterende samengevoegde kanaal. De fase scheiding en fusie gedrag van ELP amphiphiles bij het mengen van enkele PMBC bouwstenen versus geassembleerde PMBC populaties werd ook aangetoond. Mengen voorafgaand aan PMBC assemblage leidt tot homogene verdeelde moleculen binnen de geassembleerde PMBC membraan, terwijl het mengen van geassembleerde blaasjes populaties leidt tot membraan patches van rode of groene fluorescentie die zichtbaar zijn voor ten minste 20 minuten.

Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om aandacht te besteden aan de juiste stapvolgorde en aan de verschillen tussen de THF-zwellingsmethode en de butanol extrusiemethode. Volgens dit protocol kunnen de ELP-vesikels worden gebruikt als drugsleveringsshuttles, als platform voor enzymatische reacties, zoals in vitro transcriptie en vertaling, of in de vorming van synthetische minimale cellen.