Traction Force Microscopie naar Studie B Lymphocyte Activatie

Deze methode maakt het mogelijk om de ruimtelijke temporele verdeling van de krachten die door B-cellen bij immuunsynaps worden toegepast te meten en te correleren met de rekrutering van specifieke eiwitten. Traction force microscopie met polyacrylamide gels is eenvoudig te implementeren. Dit protocol kan worden gebruikt om snel de meting van de mechanische mogelijkheden van veel B-cellen in te stellen.

Deze methode is flexibel en kan worden aangepast aan andere liganden zoals integrins grafiek of om andere soorten immuun synapsen zoals T cellen of gefrustreerde fagocytose te bestuderen. Vanwege de fysische en chemische eigenschappen van de gels die nodig zijn door dit experiment, kan de aanpassing van klassieke tractiekracht microscopiemethoden aan B-cellen lastig zijn. Begin met het verzilting van de gelsteun.

Activeer de coverslip of glazen bodem Petri schotel met een UV-lamp gedurende twee minuten, dan verzilten met 200 microliter van APTMS gedurende vijf minuten. Dit zal de steun voor de covalente binding van de gel voorbereiden. Grondig wassen van de coverslip of glazen bodem schotel met ultra zuiver water en droog het met behulp van vacuüm aspiratie.

Om de coverslips voor te bereiden voor het afvlakken van de gel, leg ze in een keramische coverslip houder, zet de houder in een klein bekerglas, en giet siliconen reagens over de coverslips ervoor te zorgen dat ze volledig te dekken. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie en laat het drie minuten op kamertemperatuur. Vul ondertussen een grote beker met ultra zuiver water.

Na drie minuten incubatie in siliconen reagens, breng de coverslip houder met de coverslips naar het bekerglas met water. Spoel de covers grondig af met ultra zuiver water. Droog ze goed en leg ze op papier doekjes.

Voor de beste resultaten, ga onmiddellijk verder met gel polymerisatie. Bereid een 500 Pascal gel pre-mix volgens manuscript aanwijzingen, dan combineren 167 microliters van de pre-mix met 1,67 microliter kralen. Vortex en sonicate het mengsel in een bad sonicator voor vijf minuten.

Bescherm de mix tegen licht met aluminiumfolie. Om polymerisatie te kapitaliseren, voeg 1,67 microliter van 10% ammoniumpersulfaat toe aan de gelmix en start u polymerisatie door 0,2 microliter TEMED toe te voegen en de gel te mengen met een pipet. Om de gel te werpen, pipette negen microliters van gel mix op elke verzilte coverslip of glazen bodem schotel.

Direct plat de gel met de siliconen coverslip, druk op het met tangen om ervoor te zorgen dat de gel verspreidt zich over het hele gebied van de coverslip en dat een deel ervan lekt uit. Keer de coverslip of glazen bodem schotel in een grote petrischaal en tik op de bank om de kralen te dwingen naar de gel oppervlak. Plaats een bevochtigd weefsel op de schotel om een natte kamer te creëren.

Bedek het met aluminiumfolie en broed het een uur uit. Na de incubatie, vergemakkelijken coverslip release door toevoeging van PBS aan het monster. Verwijder de coverslip voorzichtig met een naald, iets kantelen van de schotel, maar zorg ervoor dat de gel is ondergedompeld in de PBS.

Het siliconenmiddel, acrylamide, basisacryamide en TEMED kunnen giftig zijn door inademing. Draag standaard persoonlijke beschermingsmiddelen en manipuleer deze producten onder een chemische kap. Aspirate de PBS uit de gels en voeg 150 microliter van Sulfo-SANPAH bij kamertemperatuur.

Stel de gel twee minuten bloot aan uv-behandeling en was de gel vervolgens drie keer met PBS. Herhaal de behandeling met Sulfo-SANPAH en de PBS wast, voeg vervolgens 250 microliter kippenei lysozyme of HEL toe aan de gel en broed het 's nachts uit in een vochtigheidskamer bij vier graden Celsius bedekt met aluminiumfolie. Verwijder na de incubatie het HEL-antigeen en was de gel drie keer met PBS.

Tot slot, bedek de gel met 500 microliters van B-cel cultuur media en laat het op kamertemperatuur. Gebruik een confocale microscoop met thermische en kooldioxide controle voor beeldvorming. De media uit de gel aanzuigen, waardoor er ongeveer 200 microliters overblijft.

Plaats de gel op de microscoop. Twee hoofdlagen van kralen verschijnen aan de onderkant en bovenkant van de gel. Focus op de gel vliegtuig en vind een gelijkmatig gebied om beeld.

Kies de beeldvorming gebied zorgvuldig en zorg ervoor dat in focus te blijven. Een passende kraaldichtheid en een gelijkmatig oppervlak zijn de sleutel tot het verkrijgen van robuuste en betrouwbare krachtmetingen. Voeg 80 microliter primaire B-lymfocyten van MD4-muizen toe aan de gel, waardoor de gel niet wordt aangeraakt om de focus te behouden.

Zorg ervoor dat de focus nog steeds correct is en dat cellen kunnen worden zien aflopend in het gebied. Start de overname voordat de cellen de gel bereiken. Open de film als een stapel afbeeldingen in ImageJ en voer vervolgens de macro cropandsave.ijm uit.

Kies een uitvoermap en configureer de instellingen voor het kenmerkkanaal. Selecteer de interessegebieden met het rechthoekgereedschap en voeg ze toe aan de ROI-lijst met de T-toets. Klik op OK als u klaar bent. Wanneer de macro een masker van de cel voorstelt, klikt u op OK als deze bevredigend is.

Als u niet bevredigend bent, klikt u op niet OK en selecteert u vervolgens handmatig een gesloten gebied met een selectiegereedschap en klikt u vervolgens op Doorgaan. Open MATLAB en run tfmv1.m. Voer de vereiste parameters in.

Controleer specifiek de eigenschappen van afbeeldingen, zoals pixelgrootte en tijdsinterval van acquisitie en de geleigenschappen zoals Young modulus E en Poisson ratio. Zoek de uitvoer van de software in dezelfde map als het oorspronkelijke bestand als de uitvoer van de software. Juiste kraal beelden zien eruit als een uniforme en willekeurige verdeling van heldere vlekken vergelijkbaar met een sterrenhemel.

Gegevens en analyse zijn niet betrouwbaar wanneer het aantal kralen te laag is of het beeld onscherp is. Het is mogelijk om de beweging van kralen met het oog te observeren met behulp van een referentiekader dat voorafging aan het eerste contact van de cel met het substraat. Geschatte resultaten kunnen worden verkregen uit single particle tracking.

De analyse biedt een segmentatie van de kralen in de referentieafbeelding als besturingselement. Met behulp van software is het ook mogelijk om het verplaatsings- en stressveld te verkrijgen, de vector van de lokale stress bij elke pixel en elk keerpunt. Scalar product van de verplaatsing en kracht velden geïntegreerd op het gebied van de cel biedt totaal werk uitgeoefend door de cel op het substraat.

Bij het vergelijken van twee biologische omstandigheden kan een gemiddelde curve of een gemiddelde waarde over de laatste tijdstippen waar de energie een plateau bereikt, worden berekend. Wanneer ruimtelijke informatie van de krachten relevant is, is het ook mogelijk om enkele tijdspunten van elke aandoening te vergelijken. Een voorbeeld van fluorescentie antigeen extractie time-lapse wordt hier getoond.

De progressieve verschijning van fluorescerende signalen bij de synapse duidt op antigeenloslating van de gel. De fluorescentiegegevens kunnen worden gebruikt om een gemiddelde extractiecurve te construeren. De meest delicate stap in het protocol is de polymerisatie van de gel onder de coverslip.

Deze stap moet relatief snel en zorgvuldig worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de gel gelijkmatig onder de dekens wordt geperst. Na deze procedure kan fluorescerend eiwit dat B-lymfocyten uitdrukken, worden gebruikt om tegelijkertijd de lokalisatie van intracellulaire structuren en krachtpatronen te beoordelen. Deze techniek kan worden gecombineerd met genetische of chemische verstoringen om de rol van specifieke eiwitten op celcontractiliteit en antigeenopname te beoordelen.