Functionalisatie van atomaire kracht Microscoop Cantihefbomen met single-T cellen of één deeltje voor immunologische eencellige kracht spectroscopie

Dit protocol beschrijft hoe de AFM cantilevers het beste kunnen functionaliseren met behulp van enkele T-cellen en vaste deeltjes. Deze tips kunnen vervolgens worden gebruikt om single-pair dendritische cel-T-celinteracties te onderzoeken en om cellulaire reacties van wispelturige grootte te controleren. Een groot voordeel van deze techniek is dat het gebruik maakt van een biocompatibele lijm voor een enkele T-cel functionalisatie van cantilevers.

Deze lijm is inert voor eukaryotische cellen, waardoor T-cellen in hun basislijnactiveringsfase blijven. Deze methoden geven inzicht in immuuncelactivering en complexe intercellulaire gebeurtenissen, zoals immuunsynapsformatie. De methoden kunnen ook worden uitgebreid naar andere systemen met betrekking tot cel-cel of cel-oppervlak interacties.

Voor iemand die nieuw is voor deze techniek, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de T-cellen in goede staat zijn voorafgaand aan het gebruik en dat ze 's nachts met IL-2 zijn behandeld. Bovendien, bij het gebruik van de biocompatibele lijm, snel bewegen om het te beschermen tegen onnodige oxidatie. Om deze procedure te beginnen, bereid je de enkele T-cellen voor op microscopie door mee te volgen in het tekstprotocol.

Bereid vervolgens glazen coverslips gezaaid met DC2.4 cellen, en broeden de cellen 's nachts in een bevochtigde kamer op 37 graden Celsius en 5% CO2. Schone zachte, puntloze cantilevers met een lage veerconstante met piranhabehandeling, plasmareiniging of UV-ozonreiniging. Monteer vervolgens de gereinigde cantilever op de AFM-scankop.

Bereid vervolgens een schone monsterkamer en vul deze met zuiver water. Kalibreer de cantilever in de wateroplossing door eerst een krachtcurve op het glazen substraat te draaien om de gevoeligheid van de cantilever te verkrijgen. Neem vervolgens een thermisch ruisspectrum op om de veerconstante te extraheren.

Wanneer de cantilever goed is gekalibreerd, verwijder de AFM-scankop uit de oplossing. Was de gemonteerde cantilever met een paar druppels pure ethanol en houd de cantilever droog op de scankop. Verwarm een leefcelomgeving voor op 37 graden Celsius met 5%CO2.

Monteer vervolgens de glazen coverslip gezaaid met DC2.4 cellen aan de monsterkamer assemblage, en voeg onmiddellijk 600 microliter van Medium B aan de kamer. Plaats de voltooide montage op de AFM-monsterfase. Voeg menselijke IL-2-geïncubeerde CD4-positieve T-cellen toe aan de monsterkamer.

Wacht tot de targeting T-cellen volledig zijn afgerekend op de onderkant van de coverslip en breng de cellen vervolgens onder de microscoop in het gezichtsveld. Voeg nu een twee-microliter druppel biocompatibele lijm toe aan het einde van de gemonteerde cantilever met een pipet. Zodra de biocompatibele lijm is toegepast op de cantilever, moeten de volgende stappen zo snel mogelijk worden voltooid om de hechting te maximaliseren.

Plaats snel de scankop op het monsterstadium en dompel de met lijm bedekte cantilever onder in de oplossing. Verplaats de monsterfase totdat een health T-cel zich onder de punt van de cantilever bevindt. Pas vervolgens de positie fijn aan door de scankop te bewegen.

Vervolgens laat u de cantilever handmatig zakken. Begin met een stapgrootte van 50 micron en verlaag vervolgens geleidelijk tot 10, vijf en twee en uiteindelijk 0,5 micron, zoals aangegeven door de scherpte van het cantilever-beeld. Houd nu de positie van de steppermotoren vast en pas de positionering van de scankop aan om de cantilever-tip en de cel beter uit te lijnen.

Ga door totdat stevig contact wordt aangegeven door een kleine verplaatsing van de positie van de laser, wat overeenkomt met een typische kracht van 0,5 tot 1,5 nanonewton. Trek na 30 seconden contact de cantilever in. Als de cel beweegt met de cantilever, is de bevestiging geslaagd.

Zo niet, herhaal de adhesie stap tot drie keer voordat u overschakelt naar een nieuwe cantilever. Plaats de bijgevoegde T-cel boven een DC2.4-cel door de monsterfase en de scankop te verplaatsen. Na het instellen van de juiste parameters, uitvoeren kracht spectroscopie over het monster.

Voor een nieuwe ronde van indringende, monteer een nieuwe, schone cantilever. Kalibreer het in zuiver water, en ga dan terug naar een T-cel-dendritische cel paar en herhaal de scan. Monteer een gereinigde glazen coverslip naar de monsterkamer assemblage.

Voeg aan de linkerkant van de coverslip een druppel van een kraaloplossing toe die is verdund in ethanol en met een diameter van zes micron polystyreen bevat. Zodra het oplosmiddel verdampt, controleer de afstand van de kralen met behulp van een helder-veld microscoop uitgerust met een 20x doelstelling. Zorg ervoor dat de afzonderlijke kralen goed gescheiden zijn.

Vervolgens, dip een micropipette tip of een tandenstoker in een goed gemengde epoxy lijm, en breng een kleine hoeveelheid van de lijm naar drie afzonderlijke plekken met opeenvolgende zachte aanrakingen aan de rechterkant, maar dicht bij het midden van de coverslip, zoals hier getoond. Monteer vervolgens een gereinigde, puntloze cantilever aan de AFM-scankop en kalibreer deze in de lucht met een schoon oppervlak om de veerconstante te verkrijgen. Plaats vervolgens de cantilever-tip over de linkergrens van de laatste epoxylijmvlek en breng de cantilever langzaam dicht bij de lijm met behulp van kleine stapmaten op de steppermotoren.

Zodra er contact is gemaakt met de lijm, trek je de cantilel zijdelings zijdelings door de AFM-scankop naar achteren te bewegen. Verwijder overtollige lijm door het af te wrijven tegen het glas, waardoor slechts een kleine hoeveelheid van de lijm aan het einde van de tip. Nu, verplaats de cantilever tip op de top van een goed geïsoleerde kraal.

Benader de enkele kraal langzaam, en maak een stevig contact met het in het bereik van twee tot vijf nanonewton voor ongeveer 10 seconden. Gebruik tijdens het maken van contact de fijne puntaanpassing om de kraal helemaal aan het einde van de punt te positioneren. Trek de tip aan het einde van het contact in.

Als de kraal uit het oorspronkelijke brandpuntsvlak verdwijnt, is er een geslaagde hechtingsgebeurtenis opgetreden. Ten slotte, demonteer de kraal-gemodificeerde cantilever zorgvuldig, en bewaar het in een cantilever doos 's nachts voor de epoxy volledig te genezen. Hier zijn typische kracht-afstand bochten van de bindende interactie tussen een enkele T-cel en een enkele dendritische cel in de loop van een aanpak-intrek cyclus.

De lichtrode curve is de verlengcurve en de donkerrode curve. De minimumwaarde in de curve geeft een maat voor de maximale hechtingskracht tussen de T-cel en de dendritische cel, en het gebied onder de curve vertegenwoordigt het werk dat nodig is om ze te scheiden. De scherpe en stapsgewijze breukgebeurtenissen kunnen worden geïnterpreteerd als membraantethers die uit het celoppervlak worden getrokken als gevolg van de sterke binding op de celcelinterface en vervolgens discreet breken onder het continu trekken.

Hier wordt conventionele T-celbinding aan dendritische cellen weergegeven in grijs en wordt de regulerende T-celbinding aan dendritische cellen in het blauw weergegeven. De hechtingskrachten tussen een conventionele T-cel en een regulerende T-cel herkennen peptideantigenen die worden gepresenteerd door antigeen-presenterende cellen, terwijl regulerende T-cellen suppressor T-cellen zijn die conventionele T-celgemedieerde immuniteit tegen het einde van een immuunreactie uitschakelen. Dit schema van een fluorescerende, fagocytische RAW264.7 cel toont de cel wordt benaderd met een enkele naakte, zes-micron diameter, polystyreen kraal.

Bij het inschakelen van de kraal wordt membraan PIP2 gesorteerd op de contactlocatie, in de buurt van b, die vervolgens de aanwerving van moesin induceert, wat resulteert in een fagocytische gebeurtenis. Naast de hier beschreven procedure kan op afm-gebaseerde eencellige krachtspectroscopie samen met fluorescentiebeeldvorming worden gebruikt om immuuncelactivering in realtime op het eencellige niveau te bestuderen. Gecombineerde fluorescentie technieken, deze methode maakt het mogelijk voor het aanpakken van meer complexe cellulaire processen in real time, zoals de vorming van een immuunsynaps tussen dendritische cel en T-cel pair.