Substructuur Analyzer: Een gebruiksvriendelijke workflow voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in fluorescentiemicroscopie beelden

Substructure analyzer is een gebruiksvriendelijke workflow die automatische analyse uitvoert van meerdere procesmicroscopiestatistieken. Het betekent niet nul ton van open source software Icy en ook met behulp van machine functionaliteiten. Belangrijk is dat deze workflow is betaalbaar resort produceren kennis en beelden analyse.

Multi-channel beelden worden geladen binnen de workflow en voorbewerkt om de signaal-ruisverhouding te verbeteren en om beeldvorming of defecten te verwijderen. Vervolgens isoleert beeldsegmentatie gebieden van belang, ook wel ROI's genoemd op de achtergrond. Afhankelijk van het clusteringniveau en de aard van de objecten van belang zijn er verschillende segmentatiemethoden beschikbaar.

Gesegmenteerde objecten worden opgeslagen met een specifieke beschrijving in een specifieke map. Kracht en signalen worden vervolgens geanalyseerd binnen de rijen en meerdere functies zoals locatie, grootte, vorm in dichtheidstexturen, maar aantal en grootte worden geëxporteerd naar een automatisch gemaakte spreadsheet. Download Icy van de Icy website.

Download vervolgens Substructure Analyzer Protocol uit de Icy-bibliotheek van protocollen. Open IJs en klik op gereedschappen in het lintmenu. Klik op protocollen om de interface van de protocolleneded te openen.

Klik op belasting en open de protocolonderbouwanalyse. Het laden van protocollen kan enkele seconden duren. De werkstroom bestaat uit 13 algemene blokken die elk blok werken als een pijplijn die bestaat uit verschillende vakken die specifieke subtaken uitvoeren.

Elk blok of vak is genummerd en heeft een specifieke rang binnen de werkstroom. Door op dit nummer te klikken, wijst u de hoogst mogelijke positie toe aan het eerste aan het geselecteerde blok. Posities van de andere blokken worden gereorganiseerd.

Door op het pictogram linkerbovenhoek te klikken, kan het blok worden samengevouwen. Het kan ook worden vergroot, vernauwd of verwijderd. Elke pijplijn van de werkstroom is correct ontstaan door een netwerk van vakken die zijn verbonden door andere invoer en uitvoer.

Als u een verbinding wilt maken, klikt u op een uitvoer en blijft u behouden totdat de cursor een invoer heeft. Verbindingen kunnen worden verwijderd door op de uitvoertag te klikken. Indien nodig de naam van de bestanden wijzigen, zodat sequenties worden samengevoegd, hebben dezelfde namen voorvoegsel gevolgd door verschillende scheidingsteken.

Reeksen van afzonderlijke kanalen uit een afbeelding A worden bijvoorbeeld afbeelding A genoemd, afbeelding A onderstreept blauw, enzovoort. Maak in dezelfde map een nieuwe map per kanaal om samen te voegen. Als u bijvoorbeeld rode, groene en blauwe kanalen wilt samenvoegen, maakt u drie mappen en slaat u de bijbehorende reeksen in deze mappen op.

Gebruik alleen de kanaals voor het samenvoegen van blokken, verwijder de andere blokken en sla het protocol op als samenvoegkanalen. Toegang tot de vakken om parameters in te stellen. Kies in het vak kanaalnummer x welk kanaal u wilt extraheren.

In klassieke RGB-afbeeldingen is nul rood, één groen en twee is blauw. In het vak, map kanaal nummer x, Backslash de naam van de map met afbeeldingen van kanaal x. In het vak, afzonderlijk kanaalnummer x.

Het scheidingstekengebruik voor afbeeldingsnaam. Geef in het vak kleurkaartkanaalnummer x aan met een getal welke kolom van het model moet worden gebruikt om het overeenkomstige kanaal in Icy te visualiseren. Schrijf in het vak de indeling van samengevoegde afbeeldingen en schrijf de extensie om samengevoegde afbeeldingen op te slaan.

Klik in de linkerbovenhoek van het kanaalblok samenvoegen op de koppeling direct rechts van de map. Dubbelklik in het geopende dialoogvenster dat wordt weergegeven op de map met reeksen van het eerste kanaal dat is gedefinieerd in het mapkanaal nummer één van de vakmap. Klik dan op open, liep het protocol.

Samengevoegde afbeeldingen worden opgeslagen in een samengevoegde map in dezelfde map als de mappen van afzonderlijke kanalen. Objectsegmentatie is de meest uitdagende stap in beeldanalyse. De efficiëntie bepaalt de nauwkeurigheid van de resulterende ingestelde metingen.

Dus, structuur analyzer integreert zowel eenvoudige als meer complexe algoritmen om verschillende alternatieven aangepast aan de complexiteit van het beeld en de behoeften van de gebruiker voor te stellen. Als objecten elkaar niet raken, hoeft een andere gebruiker geclusterde objecten niet afzonderlijk te onderscheiden met de bloksegmentatie A.Wanneer objecten elkaar niet raken, maar sommige objecten zich in de nabijheid bevinden, gebruikt u de bloksegmentatie B.Voor objecten met een hoog clusteringniveau en een bolle vorm gebruikt u de bloksegmentatie C.Als objecten een hoog clusteringniveau vertonen en onregelmatige vormen hebben en onregelmatige vormen hebben , gebruik de bloksegmentatie D.Gebruik de bloksegmentatie in clusterscytoplasma om het aanraken van cytoplasma afzonderlijk te segmenteren met behulp van gesegmenteerde kernen als markeringen. Blokadaptief voor primaire objectsegmentatie kan onafhankelijk worden verwerkt, zodat meerdere blokken in dezelfde run kunnen worden gebruikt om hun efficiëntie voor een bepaalde substructuur te vergelijken of om verschillende typen substructuren te segmenteren.

Ter illustratie van segmentatie, het blok segmentatie B, dat past bij een groter aantal problemen is gekozen. Om deze blog te gebruiken. Koppel het eerst aan de map.

Roept vervolgens kanaalsignaal in om het kanaal van het object in te stellen op segment. Als u bijvoorbeeld overeenkomt met de B, wordt in vak HK de parameter intensiteitsklassen en de geschatte minimum- en maximumgrootte in pixels van te detecteren objecten ingesteld. Voor intensiteitsklassen wordt een waarde van twee pixels ingedeeld in twee klassen, achtergrond en voorgrond.

Het wordt dus aangepast wanneer het contrast tussen de objecten en de achtergrond hoog is. Als objecten op de voorgrond de oorsprongsintensiteiten hebben of als het contrast met de achtergrond laag is, verhoogt u het aantal klassen. In vak actieve contouren optimaliseren de detectie van objecten randen.

Tijdens het proces wordt een map gemaakt om afbeeldingen van gesegmenteerde objecten op te slaan. Geef deze map in vaktekst bijvoorbeeld een naam, waarbij ze kernen segmenteert. Als u de indeling wilt instellen voor het opslaan van afbeeldingen van gesegmenteerde objecten, vult u de vaknotatie van afbeeldingen van gesegmenteerde objecten en heeft u het protocol uitgevoerd.

De map wordt gemaakt in de map met samengevoegde afbeeldingen. Er zijn verschillende blokken ontwikkeld om zich aan te passen aan het aantal wetten en kanalen en celcompartimenten dat in gesegmenteerde objecten moet worden geanalyseerd. Kies in het volgende voorbeeld voor de analyse de blokfluorescentieanalyse P.Two-kanalen in hetzelfde compartiment en koppel deze aan de map.

Het segmentatieblok had moeten worden verwerkt voordat deze analyse de ROI van de parameters inboxmapafbeeldingen instelt, de naam van de map met afbeeldingen van gesegmenteerde objecten die zijn voorafgegaan door een backslash. Inbox-indeling van afbeeldingen van gesegmenteerde objecten, schrijf de indeling die wordt gebruikt om afbeeldingen van gesegmenteerde objecten op te slaan. Inbox doden randen om beide objecten te verwijderen.

Anders, op dit moment, de installatie van de meer volledig J-collectie van beeldvorming is vereist om deze functie te gebruiken. In dozen kanaal spot signaal, stel het kanaal waar vlekken moeten worden gedetecteerd. In klassieke RTP-afbeeldingen is nul rood Een is groen en twee is blauw.

In dozen naam van gelokaliseerde molecuul, schrijf de naam van het molecuul lokaliseren in de vlekken. Het aantal velden dat moet worden beantwoord, is afhankelijk van het aantal moleculen. In dozen golflengten per detector blok, stel vlekken detectie parameters voor elk individueel kanaal.

Als u verschillende blokken in een ruimte wilt verwerken, moet u verbindingen van gekozen blokken behouden, met de map blok selecteren. Zorg ervoor dat hun gelederen onder de goede verwerking van de workflow. Voordat u de werkstroom uitvoert, wordt het ook aanbevolen om ongebruikte blokken te verwijderen en het nieuwe protocol met een andere naam op te slaan.

Klik op hardlopen om de werkstroom te starten. Wanneer het opent ogen kijken boeken verschijnt. Dubbelklik op de map met de verpleegkundige afbeeldingen Klik vervolgens op Openen, de werkstroom wordt automatisch uitgevoerd.

Als de verwerking is voltooid, wordt de met succes uitgevoerde werkstroom weergegeven in de rechterbenedenhoek, alle blokken worden gemarkeerd met het groene teken. Zo niet, dan geven het blok en het binnenvak met het pijlteken de juiste elementen aan. Belangrijk is dat verschillende displays het mogelijk maken om de tussenliggende resultaten tijdens elke run te visualiseren om de verwerking te controleren.

De snelheid, flexibiliteit en functionaliteit van deze workflow zal worden beperkt tot verschillende voorbeelden. In dit eerste voorbeeld analyseren we de nucleaire translocatie van NF kappa B.After simulatie met toenemende concentraties van TNF alpha. Kernen en cytoplasma werden afgebakend met behulp van segmentatie C en E blokken.

De NF kappa B floreren in signaal werd geanalyseerd met behulp van de wereldwijde translocatie analyse blok. Meer dan 40.000 cellen in 96 beelden werden geanalyseerd in 26 minuten. De gegenereerde gegevens werden gebruikt om deze dosisresponscurve vast te stellen die de inductie van NF Kappa B nucleaire translocatie door TNF alpha weergeeft.

De werkstroom kan ook worden gebruikt om bestandsgrootte te detecteren en specifieke informatie over hun functies te extraheren. Hier werden eigenschappen in individuele cellen gedetecteerd door de EDC te lokaliseren voor eiwitten. Kernen in cytoplasma werden afgebakend met behulp van segmentatie A en E blokken.

EDC4 werd geanalyseerd met behulp van fluorescentie analyse blokken C.In dit voorbeeld, cytoplasma EDC4 teken zijn gedetecteerd in beide geanalyseerde cellen. De grootte in pixels van elke volledige zijde wordt gegeven in de spreadsheet. In dit voorbeeld maakten we gebruik van de veelzijdigheid van de workflow om koolhydraten te bestuderen een langere kinetiek van oxidatieve stress.

Nucleaire kracht teken van coilin zijn de belangrijkste structurele componenten van koolhydraten Hun aantal en grootte werden geanalyseerd op basis van grootte, stress status, beoordeeld door dubbele streng breekt gelokaliseerd met 53BP1. Kernen werden afgebakend met behulp van segmentatie proxy, Nucleaire kracht en signalen van coillin en 53BP1, werden gelijktijdig geanalyseerd met behulp van fluorescentie analyse Block B.Using gegevens van 2300 individuele cellen, we bewezen een aanzienlijke toename van het aantal Greenfield site na stress inductie geassocieerd met een afname van hun grootte. Deze gegevens suggereren sterk dat oxidatieve stress verandert de nucleatie kracht van een koolhydraten in het gebruik van een nucleaire plasmische distributie in het aantal kleinere nucleaire voor de site om een verandering in coilin expressie te rechtvaardigen kan veranderen de lokalisatie en de nucleatie van curve lichamen te veranderen.

Een exogene GFP coilin fusion eiwit werd overuitgedrukt. Kenmerken van ons lichaam werden geanalyseerd volgens GFP coilin overexpressie niveau. Kernen werden afgebakend met behulp van segmentatie blok A.De fluorescerende signalen van coilin en GFP coilin, werden gelijktijdig geanalyseerd met behulp van fluorescentie analyse blok B.The overexpression niveau van GFP coilin werd weerspiegeld door de betekenis dichtheid van het GFP-signaal in individuele kernen.

Gegevens gegenereerd door substructuur analyzer blijkt dat GFP coilin in overexpressie aanzienlijk verhoogt de grootte en het aantal koolhydraten. Sinds oxidatieve stress verhoogt het aantal koolhydraten, maar vermindert hun grootte. Deze gegevens kunnen weerspiegelen dat oxidatieve stress effect op de structuur van koolhydraten wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een verandering van hun samenstelling in plaats van door een effect op bepaalde hoeveelheid coilin.

Dus structuur analyzer is een zeer modulaire workflow voor bio-beeldanalyse. Het kan worden aangepast aan verschillende contexten, van het eenvoudig samenvoegen van kanalen tot de kwantificering van meerdere verdiepingen en signalen in duizenden cellen. Het integreert ook eenvoudige en complexe segmentatiealgoritmen, afhankelijk van de complexiteit van het beeld en automatiseert de extractie van fluorescerende signaalfuncties.