Een analytisch instrument dat cellulaire morfologie Veranderingen van Drie-dimensionale Fluorescentie afbeeldingen kwantificeert

Het algemene doel van deze procedure is het bieden van een geautomatiseerde methode om veranderingen in de morfologie van een cel met een ongedefinieerde vorm, afkomstig uit driedimensionale confocale fluorescentiebeelden, te analyseren en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst het chemische stimulatie-experiment uit te voeren, waarbij cellen worden opgenomen die zijn behandeld met een agonist, cellen behandeld met een antagonist gevolgd door een agonist, en cellen zonder behandeling. Vervolgens worden de cellen klaargemaakt voor immunofluorescentie-analyse.

De tweede stap is het verkrijgen van multispectrale driedimensionale fluorescentiebeelden. Vervolgens wordt een driedimensionale morfometrische analyse uitgevoerd met behulp van de computersoftware ameris neuroscience, ameris XT en MATLAB. De fenotypische veranderingen in individuele cellen, gevisualiseerd via de driedimensionale morfometrische analyse, worden in de laatste stap geanalyseerd en gekwantificeerd.

Uiteindelijk wordt dit softwareplatform gebruikt om veranderingen in de celvorm na receptoractivatie te kwantificeren, wat een aanvullende tool biedt voor geneesmiddelenonderzoek. Over het algemeen hebben onderzoekers een standaardexpertise in biologische systemen, maar zijn zij mogelijk niet bekend met computerapplicaties. In dit protocol in de I 60-module wordt de kloof tussen visualisatie en computertaal overbrugd voorafgaand aan de start van deze procedure.

Transfect menselijke embryonale niercellen met hemagglutinine-getagde corticotropine-afscheidende factor receptor twee of CRF R twee, zoals beschreven in het geschreven protocol. CFR twee is een G-eiwitgekoppelde receptor of GPCR. Vlamdebuisjes de volgende dag na de transfectie en plaats deze in een zes-wells plaat.

Voeg 10 milliliters PBS toe aan een vial met vijf milligrams geliofiliseerd polylysine en meng dit. Verdun vervolgens vijf milliliters van het opgeloste polylysine in 500 milliliters PBS en breng twee milliliters van het mengsel aan op elk van de dekglasjes. Laat de plaat met dekglasjes 20 minuten op kamertemperatuur staan. Was de dekglasjes na 20 minuten door twee milliliters PBS toe te voegen en vervolgens weer te verwijderen; herhaal dit proces twee keer.

Voeg, na het toevoegen van twee milliliter DMEM-medium met 10% FBS, twee tot vijf druppels cellen toe aan de dekglasjes. De cellen moeten de juiste concentratie hebben om een confluentie van 60% te bereiken. De volgende dag.

Incubeer de cellen de volgende dag gedurende de nacht bij 37 °C. Controleer of de cellen voor 60% confluent zijn voor de behandeling met de agonist. Stimuleer de geselecteerde cellen door het medium te vervangen door 2 mL medium aangevuld met de CRF R2 endogene ligand corticotropin releasing factor in een concentratie van 1 µM.

Incubeer de cellen 30 minuten in een incubator bij 37 °C om de cellen voor te behandelen met de antagonist. Vervang het medium door 2 mL medium aangevuld met de selectieve CFR two antagonist anti salvaging 30 in een concentratie van 1 µM. Incubeer de cellen 30 minuten in een incubator bij 37 °C.

Na behandeling met de antagonist worden de cellen gestimuleerd met de agonist CRF en 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C voor onbehandelde cellen. Vervang na de behandeling het medium door twee milliliter vers medium.

Vervang het medium in elke well door twee milliliters vers medium en voeg anti-HHA toe, verdund één op duizend, na een incubatie van 60 minuten bij 37 °C. Aspireer het medium en voeg twee milliliters fixeermiddel aan elke well toe. Incubeer de plaat 20 minuten bij kamertemperatuur en aspireer vervolgens het fixeermiddel.

Was de cellen drie keer met tris-gebufferde zoutoplossing. Voeg 100 µL van de blokkeringsoplossing toe op elk dekglas en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens de bestaande blokkeringsoplossing uit de wells en voeg 100 µL van een vers secundair antilichaamcocktail toe aan elk dekglas; volg dit met een incubatie van 45 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was vier keer met TBSC door de oplossing voorzichtig via de zijwand van de well toe te voegen en te verwijderen, terwijl de laatste wasoplossing nog aanwezig is.

Pak elk dekglas op met een naald en gebogen pincet. Plaats het dekglas met de cellen naar beneden op een objectglas met een druppel Vector Shield monteermedium, fixeer dit met nagellak en laat het 15 tot 20 minuten drogen. Alexa Fluor 488 nm geconjugeerde muis-antilichamen worden gebruikt om CFR2 te visualiseren en DAPI wordt gebruikt om de kernen en het mitotische stadium te visualiseren. Om te beginnen worden de gefixeerde cellen op een fluorescentiemicroscoop gemonteerd. Om experimentele subjectiviteit te beperken, blijven de experimentele condities onbekend tot nadat de beelden zijn vastgelegd en geanalyseerd voor beeldacquisitie.

Een plan acro mat olie-objectief met een 63 x vergroting en een numerieke apertuur van 1,4 werd gebruikt in combinatie met de Zeiss LSM 510 Meta confocale microscoop, verbonden met een Coherent geïntegreerd tweefoton lasersysteem. Tijdens het proces van data-acquisitie worden de cellen zowel via multichannel als c-partitioning gecompartimenteerd om data van het kernmembraan tot aan de buitenste extracellulaire receptoruiteinden op te nemen. Verwerk de fluorescentiedata met Amaris, waarmee de visualisatie en segmentatie van een 3D-microscopie dataset mogelijk is. Gebruik vervolgens, volgens het door Amaris ontworpen algoritme, eerst surface rendering om het kernmembraan weer te geven.

Amaris bepaalt of er meer dan één kern aanwezig is in het gebied van belang, of ROI. Gebruik vervolgens het algoritme voor spotcreatie om de twee extensiespots van CFR two te lokaliseren. Om achtergrondruis en onregelmatige intensiteit van het complexe netwerk van amorf gevormde cellen te compenseren en zo de inclusie van elke eenheid fluorescentiedetectie van CFR two te maximaliseren, wordt de spotdiameter ingesteld op 0,2 micrometers, wat de kleinste eenheid binnen de afbeelding is.

Dit maakt de extrapolatie van specifieke informatie in de vorm van een gemeten intensiteit mogelijk. Integreer spotfiltering in het geautomatiseerde proces voor de creatie van spots met behulp van een Gaussisch filter. Om dataconsumptie te voorkomen, wordt de dataset geconverteerd van eight bit fixed point naar 32 bit float.

Selecteer het gecreëerde oppervlak en bepaal de exacte ruimtelijke locatie van elke spot buiten het nucleaire oppervlak door een distantietransformatie uit te voeren met het kernmembraan als referentiepunt. Zet de voxelintensiteitsgegevens om in spotcoördinatengegevens met behulp van de ameris XT-module gekoppeld aan MATLAB. Selecteer de spots en kies de statistische codering bij het statistische type.

Kies het intensiteitscentrum dat wordt gerapporteerd in het nieuw aangemaakte kanaal. Laad de gewenste kleur voor weergave en stel het bereik van de kleurkaart in voor analyse. De numerieke gegevens kunnen worden gevisualiseerd in het statistische tabblad en naar Excel worden geëxporteerd met behulp van GraphPad Prism.

Kwantificeer de resulterende gegevens en presenteer deze in grafische vorm voor statistische analyse. Voer vergelijkingen tussen groepen uit met behulp van een twee-weg ANOVA en een Bonferroni post-hoc test; presenteer de gegevens als gemiddelde plus of min standaarddeviatie. Om de kracht van deze aanpak aan te tonen, worden de cellulaire veranderingen weergegeven die voortvloeien uit de interactie van G-proteïnegekoppelde receptoren en corticotropin releasing factor receptor twee met de endogene ligand CRF.

In getransfecteerde HT K 2 93-cellen werden samengevoegde beelden gekwantificeerd en gevisualiseerd met behulp van Alexa 4 88-geconjugeerde, anti-muis secundaire antilichamen en DPI voor de visualisatie van de kernen. De resultaten tonen aan dat CRF R twee-receptoren zich in het plasmamembraan bevinden en uitsteken vanuit specifieke regio's van het celmembraan. Met behulp van conventionele 2D-analyse is het mogelijk deze subset van extracellulaire CRF R twee-receptoren alleen te detecteren als de adhesiepunten van de receptoren op de glasdekglasjes worden geanalyseerd.

Bijgevolg gaat alle andere informatie die is afgeleid van ZS gestapelde MULTISPECTRALE data verloren. Het resultaat toonde geen verschil tussen geen behandeling en de agonist. Hoewel de adhesiepunten van de receptoren drastisch verschillen wanneer de cellen met CRF worden behandeld, zijn de extracellulaire receptoren sterk verminderd, zoals blijkt uit de afname van de afstand van de spots tot het plasmamembraan.

Ze worden ook herverdeeld van voornamelijk eindige locaties naar een aantal discrete locaties. Het effect van CRF op de distributie van receptoren in het membraan wordt voorkomen door voorbehandeling met de CR2-specifieke antagonisten. 30 30.

Onder deze omstandigheden veranderen de twee CRFR-extensies niet na behandeling met CRF. De distale distributie van spots, uitgezet in kleurgecodeerde intervallen van vijf micrometer spectrum, wordt gebruikt om de afstand van de voxels tot het kernmembraan te visualiseren. Geen behandeling en voorbehandeling met een antagonist vóór behandeling met een agonist vertoonden geen significant verschil in GPCR-contractie.

Behandeling van de cellen met de agonist CRF vermindert progressief het aantal voxels met CFR2 in vergelijking met geen behandeling of in vergelijking met cellen die vooraf zijn behandeld met antagonist As na diens ontwikkeling. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van kwantitatieve imagingtechnieken om talrijke fenotypische veranderingen op enkelcelniveau te verkennen en te karakteriseren, waardoor deze celgebaseerde assay een aanvullend instrument voor profilering op enkelcelniveau is voor het proces van geneesmiddelenontwikkeling.