Een analytisch instrument dat cellulaire morfologie Veranderingen van Drie-dimensionale Fluorescentie afbeeldingen kwantificeert

Het algemene doel van deze procedure is om een geautomatiseerde methode te bieden voor het analyseren en kwantificeren van veranderingen in de morfologie van een ongedefinieerde vormcel, genomen uit driedimensionale confocale fluorescentiebeelden. Dit wordt bereikt door eerst het chemische stimulatie-experiment uit te voeren om cellen te omvatten die zijn behandeld met agonistcellen, behandeld met antagonist, gevolgd door agonist en cellen zonder behandeling. De cellen worden vervolgens voorbereid voor immunofluorescentie-analyse.

De tweede stap is het verkrijgen van multispectrale driedimensionale fluorescentiebeelden. Vervolgens wordt driedimensionale morfometrische analyse uitgevoerd met behulp van ameris neuroscience, ameris XT en MATLAB computersoftware. De fenotypische veranderingen van enkele cellen die worden gevisualiseerd door driedimensionale morfometrische analyse worden vervolgens geanalyseerd en gekwantificeerd als laatste stap.

Uiteindelijk wordt deze softwareplatform gebruikt om veranderingen in celvorm na receptoractivering te kwantificeren, wat een extra hulpmiddel biedt voor geneesmiddelontdekking. Over het algemeen hebben onderzoekers een standaardexpertise in biologische systemen, maar hebben ze mogelijk geen bekendheid met computertoepassingen. In dit protocol in I 60-module wordt de kloof tussen de visualisatie en computertaal overbrugd voorafgaand aan het begin van deze procedure.

Transfecteer menselijke embryonale niercellen met hemagglutinine getagde corticotropine-afgevende factor receptor twee of CRF R twee zoals vermeld in het schriftelijke protocol. CFR twee is een G-proteïne gekoppelde receptor of GPCR. De dag na de transfectie vlamdeksels af en plaats ze in een zesputtenplaat.

Voeg 10 milliliter PBS toe aan een flesje van vijf milligram lyofilisaat polylysine en meng. Verdun vervolgens vijf milliliter opgelost polylysine in 500 milliliter PBS en voeg twee milliliter van het mengsel toe aan elk van de deksels. Laat de plaat met deksels gedurende 20 minuten op kamertemperatuur staan. Na 20 minuten was de deksels door twee milliliter PBS toe te voegen en vervolgens te verwijderen, herhaal dit proces twee keer.

Na toevoeging van twee milliliter DMEM met 10%FBS-medium voeg je twee tot vijf druppels cellen toe aan de deksels. De cellen moeten in de nodige concentratie zijn om 60%confluency te bereiken. De volgende dag.

Incubeer de cellen een nacht bij 37 graden Celsius de volgende dag. Controleer of de cellen 60%confluënt zijn voor agonistbehandeling. Stimuleer aangewezen cellen door het medium te vervangen door twee milliliter medium aangevuld met de CRF R twee endogene ligand corticotropine-afgevende factor bij een concentratie van één micromolar.

Incubeer de cellen in een 37 graden Celsius incubator gedurende 30 minuten voor cellen die worden voorbehandeld met antagonist. Vervang het medium door twee milliliter medium aangevuld met de selectieve CFR twee antagonist anti-salvaging 30 bij een concentratie van één micromolar. Incubeer de cellen in een 37 graden Celsius incubator gedurende 30 minuten.

Na behandeling met antagonist. Stimuleer de cellen met de agonist CRF en incubeer deze 37 graden Celsius gedurende 30 minuten voor onbehandelde cellen. Vervang het medium na de behandeling door twee milliliter vers medium.

Vervang het medium in elke put met twee milliliter vers medium en voeg anti HHA verdund een op duizend toe, na een incubatie van 60 minuten bij 37 graden Celsius. Aspireer het medium en voeg twee milliliter fixeermiddel toe aan elke put. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten na het aspireren van het fixeermiddel.

Was de cellen drie keer met tris gebufferd zoutjeswater.Cain. Voeg 100 microliter bloedoplossing toe bovenop elke deksel, stip en incubeer op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Aspireer vervolgens de bestaande blotto-oplossing uit de putten en voeg 100 microliter vers secundair antilichaamcocktail toe aan elke deksel na een 45 minuten durende incubatie bij kamertemperatuur in het donker. Was vier keer met TBSC door voorzichtig de oplossing toe te voegen en te verwijderen van de zijwand van de put, terwijl je nog steeds in de laatste spoeloplossing bent.

Pak elk deksel op met een naald en gebogen pincet. Plaats de dekselcellen met de achterkant naar beneden op een glijbaan met een druppel vectorschild montagemedium met dappy fix met nagellak en laat het 15 tot 20 minuten drogen. Alexa, 4 88 nanometer conjugaat muse antilichaam wordt gebruikt om CFR twee te visualiseren en DAPI wordt gebruikt om de nucleaire mitotische fase te visualiseren om de fixcellen te beginnen monteren op een fluorescente microscoop om de experimentele subjectiviteit te beperken, houd de experimentele omstandigheden onbekend tot nadat de beelden zijn verkregen en geanalyseerd om beelden te verkrijgen.

Een plan acro mat olie, DIC objectief met 63 x vergroting en 1,4 numerieke apertuur werd gebruikt in combinatie met de zeis LSM vijf 10 meta confocale microscoop verbonden met een coherent geïntegreerd tweefoton lasersysteem. Tijdens het gegevensverzamelproces worden de cellen zowel door kanaal als c-partitie gecompartimenteerd om gegevens van de nucleaire membraan tot aan de uiterste punten van de extracellulaire receptor te omvatten. Verwerk de fluorescentiegegevens met behulp van amris, die de visualisatie en segmentatie van een 3D-microscopiedataset mogelijk maakt. Volg het door Amaris ontworpen algoritme en gebruik eerst het oppervlakterendering om de NU-nucleaire membraan te vertegenwoordigen.

Amaris zal bepalen of er meer dan één kern in het gebied van belang, of ROI, is. Gebruik vervolgens het algoritme voor het maken van spots om de CFR twee uitbreidingsspots te lokaliseren. Compenseert voor achtergrondruis en onregelmatige intensiteit van het complexe netwerk van amorfomorfe gevormde cellen om de inclusie van elke eenheid van fluorescentiedetectie van CFR twee te maximaliseren, stel de diameter van de spots in op 0,2 micrometer, wat de kleinste eenheid binnen het beeld is.

Dit maakt de extrapolatie van duidelijke informatie in de vorm van een gemeten intensiteit mogelijk. Gebruik een Gaussiaanse filter om spotfiltering in het geautomatiseerde creatieproces van de spot op te nemen. Om gegevenscat