Vereenvoudigde Reverse Genetics Methode om Recombinant Rotavirussen Expressing Reporter Eiwitten terug te vorderen

Dit protocol beschrijft een betrouwbaar en efficiënt omgekeerd geneticasysteem voor het maken van recombinant rotavirussen. Het legt ook uit hoe recombinant rotavirussen die fluorescerende marker eiwitten uit te drukken. Deze methode is eenvoudig die een minimaal aantal plasmiden en kan genereren recombinant rotavirussen die afzonderlijke fluor eiwitten uitdrukken, alsmede ook virale eiwitten.

Begin met het zaaien van BHKT7 cellen op 12-well platen. Spoel een vers samenvloeiende monolaag van cellen met PBS. Verstoor vervolgens de monolaag met trypsine-EDTA-oplossing en verhoog de cellen in vijf milliliter gmem-compleet medium.

Bepaal de concentratie van levensvatbare BHKT7 cellen met behulp van trypan blauw en een geautomatiseerde cel teller. Dan zaad twee keer 10 tot de vijfde cellen in een milliliter van GMEM in elke put van een 12-well cel kweekplaat. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius in een 5%kooldioxide incubator 's nachts.

Bereid het plasmidemengsel op de volgende dag voor op transfectie volgens de handschriftaanwijzing. Voeg vervolgens 110 microliters van voorverwarmd verlaagd serummedium toe aan elk plasmidenmengsel enpipet zachtjes op en neer om te mengen. Voeg 32 microliter transfectiereagens toe aan het mengsel.

Doe een korte centrifugatie na vortexen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Spoel ondertussen de BHKT7-cellen af met twee milliliter GMEM onvolledig medium. Voeg een milliliter SMEM onvolledig medium toe aan elke put en breng de plaat terug naar de couveuse.

Gebruik na de incubatie van 20 minuten een pipettor van 200 microliter om het transfectiemengsel druppel voor druppel aan elke put toe te voegen. Wieg de plaat voorzichtig en breng hem terug naar de couveuse. Spoel twee dagen na transfectie een vers samenvloeiende monolaag van MA104-cellen met PBS.

Verstoor de monolaag met trypsine-EDTA-oplossing en verhoog de cellen in vijf milliliter dmem compleet medium. Tel de cellen en pas de concentratie aan acht keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter dmem onvolledig medium. Voeg 0,25 milliliter MA104-cellen dropwise toe aan de putten met de transfected BHKT7-cellen.

Pas de concentratie trypsine aan op 0,5 microgram per milliliter door 0,8 microliter toe te voegen aan één milligram per milliliter trypsinevoorraadoplossing voor elke put. Verdun de resterende MA104 cellen tot een concentratie van 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in DMEM compleet medium en plaats twee milliliter in elke put van een zes-put plaat. Zes dagen na de transfectie, herstel het recombinant virus uit de transfected cellen.

Ondertrek de BHKT7 MA104 cellen aan drie cycli van vries/dooi onder steriele omstandigheden, waardoor de platen tussen een negatieve vriezer van 20 graden Celsius en kamertemperatuur worden verplaatst. Breng lysates naar 1,5 milliliter buizen. Centrifuge de buizen gedurende 10 minuten op 500 keer g en vier graden Celsius om de cellulaire puin pellet.

Verzamel de supernatant en bewaar het op vier graden Celsius. Voeg trypsine toe aan 100 microliter verduidelijkt cellysaat tot een uiteindelijke concentratie van 10 microgram per milliliter en ontcubeer het mengsel gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Bereid vervolgens een 10-voudige seriële verdunningsreeks voor, variërend van 10 tot negatief tot 10 tot de negatieve zeven in dmem onvolledig medium.

Spoel de MA104 monolegers twee maal af met twee milliliter PBS en één keer met DMEM onvolledig medium. Voeg 400 microliter lysaatverdunningen in duplicaat aan de platen toe en broed ze uit op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide, die elke 10 tot 15 minuten schommelt om de verdunningen over de monolaag te herverdelen. Bereid een agarose MEM-overlayoplossing voor door gelijke volumes voorverwarmde 2X EMEM te combineren met 1,5% gesmolten en gekoelde agarose.

Houd deze oplossing op 42 graden Celsius in een waterbad en pas de trypsineconcentratie aan op 0,5 microgram per milliliter vlak voordat u deze op cellen plaatst. Aanzuigen lysate verdunningen van de zes-put plaat. Spoel vervolgens de cellen een keer met twee milliliter onvolledig medium.

Voeg voorzichtig drie milliliter van de agarose MEM overlay oplossing op de cel monolayer in elke put. Laat de agarose uitharden bij kamertemperatuur. Breng de platen vervolgens terug naar de couveuse.

Drie dagen later, bereid een agarose MEM overlay oplossing zoals eerder beschreven en voeg neutraal rood aan een uiteindelijke concentratie van 50 microgram per milliliter onmiddellijk voor gebruik. Voeg twee milliliter van de overlay oplossing op de top van de bestaande agarose in de zes-put platen. Laat de agarose uitharden en breng de plaat terug naar de couveuse, zodat de platen met neutraal rood tegen licht worden beschermd.

In de komende zes uur, identificeer rotavirus plaques met behulp van een lichtbak. Gebruik wegwerp overdracht pipetten om duidelijk gedefinieerde plaques te plukken, herstellende agarose pluggen die zich volledig uitstrekken tot de cellaag. Verdrijving van de stekker in een 1,5 milliliter buis met 0,5 milliliter DMEM onvolledig medium en vortex het monster gedurende 30 seconden.

Versterken van de plaque geïsoleerd virus eluted in het medium door vermeerdering op MA104 monolagen of AT25 kolf met DMEM onvolledig medium en 0,5 microgram per milliliter trypsine. Voeg 600 microliter geklaarde geïnfecteerde cellysaten en 400 microliter guanidiniumthiocyyanaat toe in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. Vortex ze voor 30 seconden en broeden ze op kamertemperatuur gedurende vijf minuten.

Voeg vervolgens 200 microliter chloroform toe. Vortex de oplossing voor 30 seconden en incubeer het gedurende drie minuten. Na een microcentrifugatie van vijf minuten bij 13,000 g en vier graden Celsius, breng 550 microliters van de bovenste waterige fase over in een verse buis.

Voeg twee volumes koude isopropylalcohol toe en keer de buis vier tot zes keer om. Incubeer het monster 10 minuten op kamertemperatuur. Dan centrifugeren gedurende 10 minuten op 13, 000 keer g en vier graden Celsius.

Gooi de supernatant verlaten van de RNA pellet. Was het RNA door een milliliter van 75% ethanol toe te voegen aan de buis die het één keer omkeert en het vijf minuten op 7, 500 keer g en vier graden Celsius te centen. Laat RNA na het zorgvuldig verwijderen van de ethanol vijf tot tien minuten aan de lucht drogen.

Los vervolgens de pellet op in 15 microliters van nucleasevrij water. Voeg twee microliters van 6X DNA laadbuffer toe aan 10 microliter van het opgeloste RNA-monster. Laad het op een pre-cast 10%polyacrylamide mini gel.

Los de RNAs op door elektroforese in tris-glycine running buffer gedurende twee uur onder een constante 16 milliampere stroom. Zodra de gel run is voltooid, weken de gel gedurende vijf tot 10 minuten in water met een microgram per milliliter ethidium bromide en detecteren van de rotavirus genoom segmenten met een UV-transilluminator. Dit omgekeerde genetica protocol werd gebruikt om recombinant SA11 virussen die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd met een plaque test op MA104 cellen waardoor plaque isolatie te genereren.

De dsRNA genomen van plaque gezuiverd rSA11 wild type en SA11-UnaG virussen werden geëxtraheerd met een oplossing die fenol en guanidinium thiocyanaat, opgelost door elektroforese op een 10%polyacrylamide gel en gedetecteerd door vlekken met ethidium bromide. Zoals verwacht, het segment zeven of NSP3 dsRNA van rSA11-UnaG gemigreerd veel langzamer dan die van de rSA11 wild type als gevolg van de aanwezigheid van 2A-3xFLUnaG sequenties. Om te controleren op expressie van de UnaG fluorescerende eiwit, MA104 cellen werden besmet met wilde type en recombinant virus en onderzocht met een levende cel imager.

De analyse toonde aan dat rSA11-UnaG groene fluorescentie produceerde, terwijl er geen fluorescentie werd gedetecteerd in cellen die besmet waren met rSA11 wild type. Immunoblot analyse werd uitgevoerd om te onderzoeken of het 2A-element van rSA11-NSP3-2A-xflUnaG de expressie van twee afzonderlijke eiwitten bevorderde. Uit de analyse bleek dat NSP3-2A en 3xFL-UnaG inderdaad werden uitgedrukt als afzonderlijke eiwitten die wijzen op een functioneel 2A-element.

Voor een succesvol herstel van recombinant rotavirus is het van cruciaal belang om kwaliteitsvolle, goed onderhouden BHKT7-cellen te gebruiken voor transfectie en MA104-cellen voor meer dan zaaien en nauwkeurige hoeveelheden zeer zuivere plasmiden. Hoewel dit protocol uitlegt hoe reverse genetica systeem te gebruiken om het rotavirus NSP3 gen te wijzigen, dezelfde aanpak kan worden gebruikt om andere genen te wijzigen, zoals SP1.