Snelle, naadloze generatie recombinante poxvirussen met behulp van Host Range en Visuele Selectie

Onze methode maakt gebruik van host range selectie en fluorescerende markers voor de efficiënte en naadloze generatie van recombinant vaccina virus in een verscheidenheid van celtypes. Deze techniek combineert de snelheid van homologe recombinatie met de scarless aard van voorbijgaande dominante selectie. Daarnaast hosten we assortimentselectie om de mogelijkheid van chemisch geïnduceerde veranderingen te elimineren.

Deze methode kan ook worden gebruikt om het vacciniavirus of andere pokkenvirussen te wijzigen om vreemde genen uit te drukken, bijvoorbeeld om vaccins te genereren. Als u dit protocol alleen uitvoert met fluorescentieselectie, moet u ervoor zorgen dat u voldoende virussen screent om een relatief zeldzame recombinants te detecteren zonder PKR-selectieve druk. Deze methode is gebaseerd op de winst en het verlies van fluorescerende markers om met succes virussen te selecteren die de recombinatiecassettes hebben verworven en om virussen te detecteren die scarless opnieuw hebben gecombineerd.

Om een recombinatievector te genereren, voegt u eerst 17 microliter DNase-vrij water, 1,2 microliter van elke primer, vijf microliters van 5x PCR-reactiebuffer, sjabloon-DNA en 0,5 microliter DNA-polymerase toe aan één PCR-buis per amplicon. Voeg extra DNase gratis water toe om het uiteindelijke volume in elke buis op 50 microliter te brengen. En plaats de buizen in een thermocycler.

Smelt het DNA op 98 graden Celsius gedurende 30 seconden voor het gebruik van 25 rondes van een drie-stappen PCR protocol zoals aangegeven. Om de versterkingsproducten op een 1%agarose gel te visualiseren, voeg 10 microliters van elk DNA-product en 2 microliter laadbuffer aan elke put toe. Voer de gel voor een uur op acht volt per centimeter.

Gebruik aan het einde van de run een DNA-gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant om elke amplicon te stollen. Elute de amfionen uit de kolom met 50 microliters van DNase vrij water en onmiddellijke centrifugatie. Om een kloonvector te lineariseren, voegt u eerst een microgram van de vector, 17 microliters DNase-vrij water, 2 microliter reactiebuffer en 1 microliter EcoRI toe aan een buis voor een incubatie van een uur bij 37 graden Celsius.

Voeg aan het einde van de incubatie 0,2 picomoles van de gelinealiseerde vector 10 microliter DNase vrij water en 10 microliters van DNA-assemblagemastermix toe aan elke geïsoleerde amplicon. Incubeermonsters op 50 graden Celsius gedurende een uur. Transform aan het einde van de incubatie chemisch competente E.coli met twee microliter van het geassembleerde product volgens standaardprotocollen.

Plaat 100 microliter van getransformeerde cellen op LB agarose platen aangevuld met 100 microgram per milliliter ampicilline. Na nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius, selecteer goed geïsoleerde kolonies voor inenting in Luria bouillon aangevuld met 100 microgram per milliliter ampicilline 's nachts bij 37 graden Celsius en 225 omwentelingen per minuut. De volgende ochtend, gebruik maken van een plasmid miniprep kit om de plasmiden te isoleren.

En controleer de concentratie en zuiverheid van het DNA op een spectrofotometer. Voor recombinant virus generatie, infecteren een confluent monolayer van geschikte cellen met het virus te worden gecombineerd bij een veelheid van infectie van een in een zes-put plaat. En de geïnfecteerde cellen in te broeden op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende een uur.

Vervang aan het einde van de incubatie het supernatant in elke put door verse DMEM en gebruik een commercieel verkrijgbaar transfectiereagensagemiddel volgens het protocol van de fabrikant. Voeg een drie microgram van de recombinatie vector van belang aan elke put. Plaats de plaat 48 uur extra in de couveuse.

Voor het bundelen van de cellen van elke transfectie voorwaarde in individuele 1,5 milliliter buizen. Vries vervolgens de gepoolde cellen drie keer in voordat de resulterende lysates gedurende 15 seconden bij een 50%amplitude worden gesavreerd. Vervolgens verdunn het gesoniceerde lysaat in serie 10 tot de eerste tot de zesde concentratie in verse DMEM en voeg het één milliliter van elke verdunning toe aan individuele samenvloeiende putten van een eiwitkinase R-competente cellijn.

Plaats de cellen in de celcultuur incubator voor een uur voor het vervangen van de supernatants met vers medium en de terugkeer van de cellen naar de cel cultuur incubator. Na 24 tot 48 uur, identificeren van de recombinant virussen door fluorescentie microscopie. Plaques van recombinant virussen drukken rode fluorescentie uit als gevolg van integratie van het fusiegen mCherry-E3L.

Plaque zuiveren de recombinant virussen drie keer op wilde type RK13 cellen. Na drie rondes van plaque zuivering, infecteren RK13+E3L +K3L cellen met seriële verdunningen van de plaque lysaat. Om de ingestorte virussen te identificeren, door fluorescentie microscopie met behulp van een geschikte imaging systeem uitgerust met GFP en RFP filter kubussen.

Dan plaque zuiveren groen-only VC-R4, of kleurloze E3L plaques drie keer op RK13 + E3L + K3L cellen. Ervoor zorgen dat er geen plaques rood fluoresceren. Infecteer de cellen met ten minste 100 plaquevormende eenheden om uw kansen op het identificeren van een kleurloze plaque te verhogen.

In zeldzame gevallen kunnen meerdere infectieronden nodig zijn. Rode fluorescerende plaques in eiwitkinase R competente RK13 cellen zijn indicatief voor virale expressie van mCherry-E3L. En kleurloze plaques of plaques die alleen eGFP uitdrukken in RK13+E3L+K3L-cellen bevestigen de ineenstorting van de mCherry-E3L-selectiemarker.

Het recombinant virus VC-R4, dat zowel eiwitkinase R antagonisten mist kan niet repliceren in eiwit kinase R bevoegde RK13 cellen, terwijl het schijnbare virus VP872, die E3L uitdrukt is replicatie bevoegd. Om te bevestigen dat dit onvermogen om te repliceren in RK13-cellen alleen te wijten was aan het verlies van E3L, werd verbeterde GFP vervangen door E3L in het VC-R4-virus. Het genereerde een relevant virus met behulp van hetzelfde selectieprotocol.

Interessant, terwijl het maken van dit virus, kleurloze plaques in overeenstemming met de ineenstorting van de mCherry-E3L selectie marker werden geïdentificeerd voorafgaand aan de selectie in RK13 + E3L + K3L cellen die over het algemeen nodig zijn om littekenloze recombinaties te selecteren. Waarschijnlijk vanwege de uitgebreide sequentie-identiteit tussen de mCherry-E3L recombinatiecassette en het E3L-gen dat in VC-R4 wordt ingebracht. Gemiddeld 12,6% van de nakomelingen virionen onderging recombinatie met de transfected plasmid, vergelijkbaar met eerder gemelde frequenties.

Hier wordt de frequentie van kleurloze plaques ten opzichte van de totale plaques RK13+E3L+K3L-cellen weergegeven, waaruit blijkt dat de instortingssnelheid en het verlies van de mCherry-E3L-selectiemarker zich met een frequentie van ongeveer 1,8% hebben voorgedaan. In de eerste fase met behulp van PKR bevoegde cellen zorgt ervoor dat alle plaques met opgenomen recombinant virus. In de tweede fase met behulp van PKR gebrekkige cellen maakt de detectie van recombinant virus met een ineenstorting mCherry-E3L locus.

Deze aanpak stelt ons in staat om snel virussen te genereren die exogene genen bevatten, bijvoorbeeld voor vaccinproductie die de expressie van verschillende virale PKR-antagonisten bieden. om de analyse van soortenspecifieke interacties met PKR van verschillende gastheren te vergemakkelijken.