Begeleide machine learning voor semi-kwantificering van extracellulair DNA in Glomerulonephritis

Glomerulonephritis veroorzaakt pathologische glomerulaire verwondingen met aanzienlijke celdood en extracellulaire DNA-afgifte. Dit protocol maakt de visualisatie van extracellulair DNA op de plaats van afgifte tijdens pathologisch letsel mogelijk. Het voordeel van deze techniek is dat het extracellulair DNA van celdood in de nier meet.

In tegenstelling tot serum of urine is extracellulaire DNA-meting een surrogaatmarker voor pathologische schade. Het belang van deze methode is dat zowel de extracellulaire DNA-kleuring en beeldanalyse gemakkelijk overdraagbaar zijn naar andere auto-immuunziekten zoals reumatoïde artritis en lupus. Deze methode vereist een basiskennis van nier histologie.

Om de nauwkeurige detectie van glomerular extracellulair DNA mogelijk te maken, moet de onderzoeker glomeruli correct kunnen identificeren. Voor extracellulaire DNA-kleuring verwarmt u eerst de monsters van belang in een schuifrek in 60 graden Celsius gedurende 60 minuten voordat u de dia's onderdompelt in twee 40 minuten durende veranderingen van oplosmiddel in een rookkap. Na de tweede onderdompeling rehydrateert u de monsters twee keer in 100% ethanol en één keer in 70% ethanol gedurende vijf minuten per behandeling.

Gebruik na de laatste behandeling tangen om de glijbanen gedurende 10 minuten in kokende antigeenophaaloplossing in een snelkookpan op hoog te plaatsen. Na het ontmaskeren van de antigeen epitopes, breng de snelkookpan van warmte in een gootsteen en onmiddellijk lopen koud leidingwater over het deksel. Laat de glijbanen gedurende 20 minuten in de antigeenophaaloplossing in evenwicht brengen voordat u de monsters twee keer in 0,01 molaire PBS op een orbitale shaker gedurende vijf minuten per wasbeurt wast.

Gebruik na de tweede wasbeurt een hydrofobe pen om cirkels rond de nierweefselmonsters te tekenen en alle niet-specifieke vlekken te blokkeren met 60 microliters van 10% kippenserum in 5%runderserum albumine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervang aan het einde van de incubatie de blokkeringsoplossing zorgvuldig door 60 microliters van het primaire antilichaam van belang in een vochtigheidskamer 's nachts bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, was de dia's op een orbitale shaker in PBS gedurende twee minuten per wasbeurt alvorens 60 microliters van een geschikte fluorofofoër geconjugeerd secundair antilichaam aan elke dia voor een 40-minuten incubatie bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de incubatie, was de dia's in PBS zoals aangetoond, gevolgd door behandeling in 0,3% Soedan zwart in 70% ethanol om eventuele formeel geïnduceerde autofluorescentie te doven. Na 30 minuten was je de glijbanen in leidingwater om eventuele neerslag te verwijderen en dompel je de glijbanen 10 minuten onder in PBS om verdere Soedanzwarte neerslagvorming te voorkomen. Aan het einde van de incubatie, monteer de dia's op confocale glazen coverslips met drie 60 microliter druppels montageoplossing aangevuld met DAPI en verzegel de coverslips met nagellak.

Laat de glijbanen 24 uur op kamertemperatuur genezen. Bewaar ze op vier graden Celsius beschermd tegen licht tot beeldvorming door confocale laser scanning microscopie volgens de standaard protocollen. Zorg ervoor dat u de coverslips verzegelt met nagellak om elke beweging tijdens de beeldvorming te voorkomen en om de covers van ethanol schoon te maken om de beeldresolutie te verbeteren.

Nadat u 20 glomeruli per dia hebt weergegeven, opent u de trainbare Weka-segmentatie-plug-in in ImageJ en zet u de eerste afbeelding op de werkbalk ImageJ. Klik op afbeeldings-, kleur- en gesplitste kanalen. Er verschijnt een afbeelding met de primaire antilichaamkleuring.

Als u een samengevoegd bestand van de afzonderlijke afbeeldingen wilt maken, klikt u op kleur en voegt u kanalen samen. Er verschijnt een pop-upvak waarin wordt gevraagd om een kleur aan elk kanaal toe te wijzen. Schakel de vakjes Samengestelde maken en bronafbeeldingen bijhouden en klik op OK. Er verschijnt een samengevoegde samengestelde afbeelding.

Met behulp van de primaire antilichaam kleuring als een gids, trekken een gebied van belang rond de glomerular bos. Als u een Gaussische onscherpte wilt uitvoeren op de enkele blauwe DAPI-afbeelding, klikt u op proces, filters en Gaussische onscherpte. Stel de onscherpte in op één op twee.

Het beeld zal een beetje wazig, maar de kernen zal verschijnen glad, zal de achtergrond worden verzacht. Klik vervolgens op plug-ins, segmentatie en trainbare Weka-segmentatie en gebruik het gereedschap Vrije hand om de intacte kernen te traceren. Wanneer alle kernen van belang zijn toegevoegd, gebruikt het vak Klasse één toevoegen het lijngereedschap om de achtergrondgebieden af te bakenen aan het vak klasse twee.

Klik op nieuwe klasse maken en gebruik het lijngereedschap om het met DAPI bevlekte extranucleaire DNA te schetsen. Klik op trein classifier en krijg kans. Schakel de muis in om een zwart-witafbeelding van alle componenten te verkrijgen met het object selectie dat in het wit is gemarkeerd.

Als u deze afbeelding wilt dupliceren, klikt u op afbeelding en dupliceert u. Onder afbeelding, aanpassen en drempel. Gebruik de muisknop om de drempel aan te passen totdat alleen het extracellulaire DNA wordt waargenomen.

Klik na drempels op proces, binair en maak binair en kopieer het eerder gegenereerde glomerulaire interessegebied. Druk op Shift E voor control om bewerken, selecties en herstel te selecteren om de selectie te herstellen. Als u alleen de extracellulaire DNA-deeltjes in de glomerulus wilt meten, klikt u op analyseren van deeltjes en OK. Er wordt een resultaatblad gegenereerd met het aantal deeltjes, het gebied, de gemiddelde pixels en het percentage glomeruli dat extracellulair DNA bevat.

Als u de classificatie wilt opslaan als een extracellulaire DNA-classificatie, klikt u op classificatie opslaan en slaat u de gegevens op. Als u het model opnieuw wilt aanpassen op volgende afbeeldingen, herhaalt u de eerste beeldverwerking zoals aangetoond voordat u de laadclassificatie en het opgeslagen classificatiebestand selecteert. Het logboekmenu verschijnt en voert het model uit.

Zodra het model is uitgevoerd, klikt u op gegevens laden en selecteert u de extracellularDNA.arff. Klik vervolgens op resultaat maken. Als de resulterende afbeelding niet alle kernen, achtergrond of extracellulair DNA heeft opgepikt, klikt u op classificatie omscholen en voegt u indien nodig meer classificaties toe.

Hier worden single channel beelden getoond die representatief DNA en bèta-actin-kleuring laten zien. Door de twee beelden samen te voegen kan een bezienswaardigheid rond het glomerulaire gebied worden getrokken voor het meten van het extracellulaire DNA in de muisnierglomeruli met behulp van trainbare Weka-segmentatie, zoals aangetoond. Dit model kan worden aangenomen om extracellulair DNA te identificeren in nierbiopsiemonsters van een controlepatiënt of vergelijking met die van een nierbiopsie van een patiënt met myeloperoxidase ANCA-geassocieerde vasculitis.

Bovendien kan dit programma worden vertaald naar andere vlekken in nierweefselmonsters, bijvoorbeeld naar vlek voor neutrofiele extracellulaire vallen en de afzetting van extracellulaire myeloperoxidase in ANCA-geassocieerde vasculitis. Belangrijk is dat er geen significante verschillen worden waargenomen wanneer dezelfde gegevens door meerdere gebruikers worden geanalyseerd. De meest kritische stap van de analyse is het verstrekken van voldoende voorbeelden van achtergrond, kernen, en extracellulaire DNA met glomeruli als classifiers voor de Weka Segmentatie programma om van te leren.

Deze methode is gemakkelijk overdraagbaar. Zo kan verdere analyse van de verschillende soorten celdood worden onderzocht door kleuring voor specifieke antilichamen tegen markers voor apoptose of necrose. Onze techniek kan worden gebruikt met andere ontstekingsprocessen, zoals het beoordelen van TLR expressie in auto-immuun nierziekte of extracellulaire myeloperoxidase expressie in menselijke nierbiopten.