Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten
18 juni 2020
Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.
Huidige protocolbeoordelaars in textiel, redox toestand veranderingen in een intracellulaire compartiment-specifieke manier. Ons protocol maakt een beter begrip en monitoring van alle fysiologische of pathofysiologische mechanismen van oxidatieve stress mogelijk. Deze techniek maakt het mogelijk om de betegelde verhouding van het oogsulfide in intacte cellen niet-verstorend te kwantificeren met behulp van een ratiometrische output om de verschillen tussen signaalexpressieniveaus, fotobleektechnologie en detectiegevoeligheden te compenseren.
Dit protocol kan worden toegepast op verschillende organismen, waaronder bacteriën in planten. Op dag één van het experiment behandelen de cellen van een confluent borstkankercellijn gedurende twee minuten, met twee milliliter van 0,2, 5%-trips in EDTA. Wanneer de cellen beginnen te los arrestatie de reactie met zes milliliter van volledig medium en sediment de cellen door centrifugatie.
Stel de pellet opnieuw op in vijf milliliter vers, compleet medium, tel de cellen en verdun ze tot 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per één milliliter compleet medium. Dan zaad 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter cellen per put in een 6 put plaat, en incubeer de cellen in de celcultuur incubator 's nachts. Of voeg geen virale rij GFP transductie.
De volgende ochtend, voeg 12,5, 25, en 50 microliter van een een tot 100 verdund zes keer 10 aan de 10e plaque vormen eenheden per milliliter van voeg geen virale gfp-oplossing, in compleet medium. Voeg dat toe aan de juiste putten of de 6 putplaat om de cellen met respectievelijk 50, 100 en 200 multiplicities van infectie om te leiden. Wanneer alle van het monster Putten zijn getransduceerd met virus, de cellen terug te keren naar de cel cultuur incubator voor 16 tot 24 uur.
De volgende dag visualiseren de cellen door fluorescentie microscopie en verving de supernatant met medium, zonder virus om de cellen te herstellen voor een extra 24 uur. Om de optimale transductie-efficiëntie te bepalen, beoordeelt u de fluorescentieintensiteit en morfologie van de cellen door stromingscytometrie. Zorg ervoor dat u alle procedures die infectie kunnen veroorzaken door aerosolen of spatten binnen een bioveiligheid niveau twee gecertificeerde biologische veiligheid kabinet uit te voeren.
Om de redoxstatus van de cellen te beoordelen, broeden de cellen en de juiste putten van de 6 putplaat gedurende een uur met 10 micromolar waterstofperoxide uit, voordat de cellen worden losgemaakt met 750 microliter van 0,2 5%druppels in EDTA per put, zoals aangetoond. Stop de reactie met twee milliliter van volledig medium per put en trek de supernatants voor elke aandoening in individuele 15 milliliter conische buizen. Sediment de cellen door centrifugatie en was de pellets in 500 microliters van PBS per put door centrifugaties twee keer.
Na de tweede wasbeurt, filter de cel schorsingen door 40 micro meter mazen in flow cytometrie compatibele buizen op ijs, beschermd tegen licht. In de Flow cytometer software, voer de nul multipliciteit van infectie controle monster. Analyseer vervolgens de waterstofperoxide en onbehandelde cellen.
Hiermee kan de gemiddelde fluorescerende intensiteitsverhouding tussen de geoxideerde versus gereduceerde vormen van rijGFP worden berekend, met behulp van de formule zoals aangegeven. Hier zijn de gating strategie voor het selecteren van een groot aantal cellen door flow cytometrie wordt getoond. Flow cytometrie kan ook worden gebruikt om de dosis respons curve voor rij GFP-analyse en de meest efficiënte veelheid van infectie input te bepalen.
Volgens de veelheid van infectie, dosis respons curve in deze representatieve analyse, een 200 veelheid van infectie gaf de hoogste weg GFP expressie, maar de cel morfologie werd uitgevoerd suggereert cytotoxiciteit. Daarom werd de optimale transductie-efficiëntie vastgesteld op een veelheid van infectie van 100. In deze redox status analyse, geoxideerd en verminderde rij GFP gemiddelde fluorescentie intensiteiten werden verkregen uit flow cytometrie analyse voor voertuig en vier 10 micromolar positieve controle waterstofperoxide behandelingen.
De bedekte histogrammen vertegenwoordigen de verschuivingen in het celnummer in de 10 micromolar waterstofperoxide en voertuig behandelde groepen of verminderd en geoxideerd eroderen GFP. Berekening van de verhouding tussen de geoxideerde en verminderde rij GFP voor deze analyse bleek dat 10 micromolar waterstofperoxide veroorzaakt een drievoudige toename van oxidatie van rij GFP in vergelijking met de behandeling van het voertuig. Het hebben van nauwkeurige celnummers is belangrijk voor MRI-berekeningen en reproduceerbaarheid.
Om reproduceerbare resultaten te hebben, moeten onderzoekers de antivirale oplossingen grondig mengen om homogene suspensies te verkrijgen. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om snelle redoxveranderingen te bestuderen als een integraal onderdeel van het brede scala van normale cellulaire processen en van ziekteprogressie in real time.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het beoordelen van de subcellulaire compartiment-specifieke redoxstatus in cellen met behulp van een redox-gevoelige fluorescente sonde. Deze techniek maakt een niet-storende kwantificering van de redoxtoestand in intacte cellen mogelijk.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Redoxbiologie
- Oxidatieve Stress
Achtergrond
- Het begrijpen van redoxtoestanden is cruciaal voor het bestuderen van oxidatieve stress.
- Redox-gevoelige sondes bieden inzicht in cellulaire mechanismen.
- Veranderingen in redoxstatus kunnen fysiologische of pathofysiologische omstandigheden aangeven.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende organismen.
Doel van Studie
- Om het monitoren van oxidatieve stress in cellen mogelijk te maken.
- Om een niet-storende methode te bieden voor het kwantificeren van redoxtoestanden.
- Om het begrip van cellulaire reacties op oxidatieve omstandigheden te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Gebruik van een redox-gevoelige fluorescente sonde.
- Ratiometrische analyse om signaalverschillen te compenseren.
- Toepassing van het protocol op verschillende celtypen, inclusief kankercellen.
- Celbehandeling en centrifugatie voor monstervoorbereiding.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle kwantificering van redoxtoestanden in intacte cellen.
- Toepasbaarheid aangetoond over verschillende celtypen.
- Inzichten verschaft in de fysiologische mechanismen van oxidatieve stress.
- Mogelijkheid geboden voor het monitoren van redoxveranderingen in real-time.
Conclusies
- Dit protocol is effectief voor het beoordelen van de redoxstatus in cellen.
- Het biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van oxidatieve stressmechanismen.
- De methode kan worden aangepast voor verschillende onderzoekstoepassingen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Assessing subcellular redox dynamics enables mechanistic de-risking in target validation by linking oxidative stress pathways to disease phenotypes. This method supports predictive confidence in preclinical models through quantitative, ratiometric readouts of cellular oxidation states. It provides translational continuity from discovery to lead identification by monitoring redox changes in living systems without disrupting cellular physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying redox shifts in response to oxidative stressors like H2O2.
- Operational Value: Enables functional target validation via subcellular compartment-specific resolution of roGFP signal.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing dose-response relationships between oxidant exposure and GFP oxidation ratios.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline redox states in MDA-MB-231 cells.
- Operational Value: Delivers assay standardization through ratiometric measurement that corrects for expression variability and photobleaching.
- Scalability: Supports platform reuse across cell types and organisms as demonstrated in breast cancer and bacterial models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Connects redox measurements to disease-relevant systems using triple-negative breast cancer as a pathophysiological model.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by monitoring real-time redox changes during disease progression.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking by linking oxidative stress mechanisms to functional cellular outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing redox status as a quantifiable biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring oxidation/reduction ratios in live cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility through flow cytometry-compatible sample preparation and gating strategies.
- Analytics: Delivers quantitative readouts via mean fluorescent intensity ratios of oxidized versus reduced roGFP forms.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling real-time monitoring of redox changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for oxidative stress assessment across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in oxidative stress mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of redox measurements across experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative redox response thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, flow cytometry, and adenoviral transduction techniques.
- Needs instrumentation for dual-excitation fluorescence detection (405 nm and 488 nm) and emission at 525 nm.
- Demands cross-team standardization of transduction protocols, H2O2 treatment timing, and ratio calculation methods.
- Involves adaptation considerations for different subcellular targeting of roGFP constructs beyond cytosolic expression.
- Includes practical limitations such as cytotoxicity at high multiplicity of infection, requiring optimization for each cell type.
