Name: Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Leer hoe je subcellulaire redoxstatus beoordeelt met redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten. Deze niet-disruptieve methode kwantificeert oxidatieve stress in intacte cellen voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De construct en recombinant adenovirus voor het uitdrukken van cytosol-specifieke roGFP in cellen werden gegenereerd in het laboratorium van Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University, en ViraQuest Inc, respectievelijk. Deze studie werd ondersteund door het Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy grant P20GM109005 via het NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor's Awards AWD00053484. De flow cytometry core faciliteit werd gedeeltelijk ondersteund door het Center for Microbial Pathogenese en Host Inflammatory Responses grant P20GM103625 via de COBRE NIGMS. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het NIH. ATA werd ondersteund door de Wetenschappelijke en Technologische Onderzoeksraad van Turkije (TUBITAK) 2214-A beurs.

OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor 70%-80% confluent MDA-MB-231 cellen. Voor andere cellijnen moet het aantal cellen en de veelheid van infectie (MOI) opnieuw worden geoptimaliseerd.
1. Bereiding van cellen (dag 1)
<ol><li>Houd de MDA-MB-231 cellijn in 75 cm2 kolven met 10 mL gemodificeerd Eagle medium (DMEM) van Dulbecco aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. OPMERKING: DMEM aangevuld met 10% FBS, 37 °C en een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer worden gebruikt voor alle bevestigings- en behandelings incubaties in het gehele protocol.</li>
	<li>Bereid de MDA-MB-231 cellen voor op experiment.<ol>
<li>Aspiraat het medium in de kolf, los de cellen met 2 mL van 0,25% trypsine-EDTA oplossing voor 2 min, en inactiveren de trypsine activiteit met 6 mL van het volledige medium (DMEM met 10% FBS). Centrifugeer de cellen op 150 x g gedurende 5 min. Aspirate de supernatant en schort de cellen op in 5 mL van volledig medium.</li>
		<li>Meng een gelijke volume cel suspensie en 0,4% trypan blauw. Neem 10 μL van dit mengsel en tel de cellen met de geautomatiseerde celteller. LET OP: Een Coulter teller of een hemocytometer kan ook worden gebruikt voor het tellen van cellen.</li>
		<li>Zaad de cellen in een 6 put plaat voor flow cytometrie analyses en zaad 150.000 cellen in 1 mL van medium per put. Wacht 16 uur op celbevestiging.</li>
		<li>Zaad de cellen in een 4 put kamer dia voor fluorescerende beeldvorming en zaad 25.000 cellen in 0,5 mL van medium per put. Wacht 16 uur op celbevestiging. LET OP: Zaadcontroleputten naast de behandelingsputten. Gebruik een van de controleputten om het celnummer te bepalen (optioneel: als de bevestigingsperiode voor de cellen korter is dan de verdubbelingstijd, kan worden aangenomen dat het celnummer hetzelfde is als de zaaidichtheid) en de andere voor een niet-geïnfecteerde controle (0 MOI).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Adenovirale roGFP-transductie (dag 2 en 3)
LET OP: Adenovirussen kunnen ziekten veroorzaken. Gebruik tijdens het transduceren van de cellen gefilterde tips en ontsmettingstips, Pasteurpipettes en microcentrifugebuizen met 10% bleekmiddel.
OPMERKING: Dit protocol werd gedemonstreerd met cytosol-specifieke roGFP, maar andere cellulaire compartimenten (bijvoorbeeld mitochondriën of mitochondriale intermembrane ruimte) kunnen worden gericht met dit zelfde protocol.
<ol><li>Een dosisresponscurve genereren voor het MOI om de hoogste transductie-efficiëntie te verkrijgen door het volume van het adenovirus (mL) te berekenen dat nodig is voor elke MOI-waarde voor MDA-MB-231-cellijn(tabel 1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61229/61229equ01.jpg"> OPMERKING: Functionele titer van elke partij adenovirale voorraad, die wordt uitgedrukt als plaquevormende eenheid (PFU) per mL, wordt geleverd door het bedrijf. De optimale MOI voor transductie verschilt tussen celtypen. Voor de meeste zoogdiercellen ligt het optimale MOI-bereik tussen de 10 en 300. Volgens de cellulaire respons moeten de MOI-waarden opnieuw worden berekend (bijvoorbeeld het MOI-bereik moet worden verminderd als cellen cytotoxische respons hebben of het bereik moeten worden verhoogd als cellen een lage transductie-efficiëntie hebben).</li>
	<li>Maak 1:100 verdunning van 6 x 1010 PFU/mL adenovirale roGFP oplossing met celkweekmedium (DMEM met 10% FBS) voor betrouwbaar pipetten.</li>
	<li>Pipette en voeg 0,0125 mL (12,5 μL), 0,025 mL (25 μL), 0,05 mL (50 μL) van adenovirale roGFP verdunning toe in elke put van de 6 putplaat om de 150.000 cellen met 50 te herleiden, respectievelijk 100 en 200 MOI voor analyse van stroomcytometrie(tabel 1).</li>
	<li>Pipet en voeg 0,0042 mL (4.2 μL) adenovirale roGFP verdunning toe in de 4-kamer schuifputten om 25.000 cellen met 100 MOI voor fluorescentie beeldvorming(Tabel 1) te transduceren. OPMERKING: Een minimale hoeveelheid medium moet worden gebruikt in de putten om de hoogste interactie tussen de adenovirale roGFP-constructie en cellen te garanderen. Het serumgehalte van het kweekmedium moet mogelijk worden verlaagd voor verschillende cellijnen, omdat hoge serumniveaus de transductie-efficiëntie in sommige celtypen negatief kunnen beïnvloeden.</li>
	<li>Incubeercellen gedurende 16-24 uur onder de celonderhoudsomstandigheden. De volgende dag (dag 3), verander het medium naar cell cultuur medium (DMEM met 10% FBS) om celherstel toe te staan voor nog eens 24 uur. Visualiseer cellen onder een microscoop om hun morfologie te beoordelen; cellen kunnen roGFP uitdrukken, zelfs als ze morfologische veranderingen hebben. OPMERKING: Op dag 3 moeten cellen roGFP gaan uitdrukken; daarom kan de transductie-efficiëntie worden gecontroleerd met behulp van fluorescentiemicroscopie (filters met ex. 488/em. 525). Om consistente testresultaten te verkrijgen, moet u zich bewust zijn van en de morfologische veranderingen onder de fasecontrastmicroscoop documenteren en morfologie observeren terwijl de transductie-efficiëntie wordt geëvalueerd.</li>
	<li>Maak een dosisresponscurve aan de hand van de 50,100 en 200 MOI-monsters die in stap 2.3 zijn bereid en hun transductie-efficiëntieresultaten verkregen uit de analyse van stroomcytometrie (stappen 3.1 en 4.1). Beoordeel de optimale transductie-efficiëntie met documentatie van morfologische veranderingen (stap 2.5) en de dosisresponscurve van MOI. OPMERKING: Hoewel meer dan 98% van de celpopulatie bij 100 MOI en 200 MOI express roGFP (zie representatieve resultaten), vertoonde 200 MOI-groep aanzienlijke veranderingen in de celmorfologie van MDA-MB-231 cellen. Bijgevolg werd vastgesteld dat de meest effectieve MOI voor MDA-MB-231 cellen 100 MOI was.</li>
	<li>Na optimale MOI (hier, 100 MOI) werd gekozen voor MDA-MB-231 cellijn, uitvoeren experiment met testmaterialen (10 μM H2O2 en het voertuig 0,1% gedeïmiseerd water).<ol>
<li>Bereid en zaad de cellen volgens sectie 1. Met behulp van het adenovirale transductievolume voor 100 MOI berekend in stap 2.1, herhaal stappen 2.2−2.4 voor 100 MOI adenovirale transductie van cellen. Vervolgens incuberen de plaat en kamer dia's volgens stap 2.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Verwerving van CyS/CySS-saldo
<ol><li>Stroomcytometrie (dag 4)<ol>
<li>Op dag 4 broeden cellen uit stap 2.7.1 met 10 μM H2O2 voor 1 uur. OPMERKING: 10 μM H2O2 werd gebruikt als teststof en 0,1% gedeïïmiseerd water werd gebruikt als voertuigbehandeling in dit protocol. Andere oxiderende middelen kunnen hier als positieve controles worden gebruikt.</li>
		<li>Aspirate media van de 6 putplaat, vervangen door 750 μL van 0,25% trypsin-EDTA oplossing en wacht 2 min voor cellen los te maken. Activeer trypsine met 2 mL compleet medium (DMEM met 10% FBS) en verzamel het volume in 15 mL conische buizen.</li>
		<li>Centrifugeren de buizen op 150 x g gedurende 5 minuten bij 4ºC. Gooi supernatant weg en schorst de cellen in 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
		<li>Stap 3.1.3 herhalen</li>
		<li>Filter de celsuspensies in stroom cytometrie-compatibele buizen met behulp van 40 μm mesh. Houd de buizen op ijs en uit de buurt van het licht en volg stap 4.1 voor data-analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microscopische beeldvorming (dag 4)<ol>
<li>Behandel cellen op dag 4 met 10 μM H2O2, verwerf beelden onmiddellijk (tijdpunt 0) en 1 uur na de behandeling en volg stap 4.2 voor data-analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Gegevensanalyse
<ol><li>Flow cytometrie kwantificering<ol>
<li>Stel de flow cytometriemethode in voor 3 verschillende analyses via monsteracquisitiesoftware (zie Tabel van Materialen):forward scatter (FCS) op x-as en zijverstrooiing (SSC) op y-ass om de celgrootte en complexiteit van cellen te beoordelen (SSC kan worden gebruikt voor ruwe identificatie van dode en levende cellen); ex. 488 nm/em. 525 nm (fluoresceïne isothiocyanaat [FITC]) bandpassfilter op x-as en SSC op y-as om CyS-roGFP te beoordelen; ex. 405 nm/em. 525 nm (Brilliant Violet 510 [BV510]) bandpass filter op x-as en SSC op y-as om CySS-roGFP te beoordelen.</li>
		<li>Verwerf 0 MOI-controle en visualiseer cellen met voorbeeldacquisitiesoftware. Herhaal deze stap voor de resterende monsters (50, 100, 200 MOI-groepen en later op 10 μM H2O2 behandelde cellen en voertuig behandelde cellen). Sla de bestanden op voor gegevensanalyse.</li>
		<li>Open data-analysesoftware (zie Tabel van materialen)en open 0 MOI-voorbeeldbestand. Beoordeel de celpopulatie van belang (Poort 1). Stel de volgende gatings in om de achtergrondfluorescentie voor ex. 488 nm/em te minimaliseren. 525 nm (Poort 2) en ex. 405 nm/em. 525 nm (Gate 3) bandpass filters met de niet-geïnfecteerde (0 MOI) controlecellen.</li>
		<li>Open 50, 100 en 200 MOI-voorbeeldbestanden in data-analysesoftware om de dosisresponscurve te beoordelen. Analyseer gemiddelde fluorescentieintensiteiten met Gates 2 en 3 voor elk monster. Herhaal deze stap voor testmonsters (10 μM H2O2 behandelde cellen en met voertuigen behandelde cellen).</li>
		<li>Bereken de gemiddelde fluorescerende intensiteitsverhouding tussen geoxideerde versus gereduceerde vormen van roGFP met de volgende vergelijking.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61229/61229equ02.jpg">
<ol start="2"><li>Beeldbeoordeling<ol>
<li>Gebruik een microscoop die fluorescentiefilters bevat voor CyS-roGFP en CySS-roGFP (ex. 488 nm/em. 525 nm en ex. 405 nm/em. respectievelijk 525 nm filters).</li>
		<li>Kies in elke put van de kamerdia 4 willekeurige gebieden om afbeeldingen te verkrijgen, met behulp van de 4x doelstelling om grotere gebieden te visualiseren. OPMERKING: 20x doelstelling kan ook worden gebruikt voor beelddisplays.</li>
		<li>Open de afbeelding met ImageJ-software11. Analyse toepassen | Meet opdrachten voor elke afbeelding en gebruik de vergelijking in stap 4.1.5 om de gegevens te kwantificeren. OPMERKING: Kwantificering van de afbeeldingen is ratiometrisch; Daarom omvat het protocol geen aftrekking van de achtergrond. Echter, om te kunnen beelden te vergelijken, helderheid, contrast, en verzadiging moet hetzelfde zijn voor elke afbeelding. Statistische significantie werd beoordeeld met eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) en de post hoc-test van Tukey.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%3A+A+concept+in+redox+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li>
<li>Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signalling%22%5BJournal%5D)">Redefining Oxidative Stress.</a> Antioxidants & Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).</li>
<li>Pizzino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress%3A+Harms+and+Benefits+for+Human+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763(2017).</li>
<li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol%2Fdisulfide+redox+states+in+signaling+and+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).</li>
<li>Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+Mitochondrial+Compartmentation+of+Oxidative+Stress+and+Redox+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).</li>
<li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li>
<li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li>
<li>Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+intracellular+redox+conditions+using+GFP-based+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).</li>
<li>Bhaskar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reengineering+Redox+Sensitive+GFP+to+Measure+Mycothiol+Redox+Potential+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902(2014).</li>
<li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+oxidant+stress+triggers+cell+death+in+simulated+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menadione+triggers+cell+death+through+ROS-dependent+mechanisms+involving+PARP+activation+without+requiring+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).</li>
<li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+GFP+to+monitor+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).</li>
<li>Meyer, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li>
<li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li>
<li>Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+organisms+meet+redox+bioimaging%3A+One+step+closer+to+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).</li>
<li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li>
<li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li>
<li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De thiol/disulfide balans in een organisme weerspiegelt de redoxstatus van cellen. Levende organismen hebben glutathion, cysteïne, eiwittholen en thiolen met een laag moleculair gewicht, die allemaal worden beïnvloed door het oxidatieniveau en echo van de redoxstatus van cellen4. Engineered roGFP's maken de niet-verstorende kwantificering van het thiol/disulfide-saldo mogelijk via hun CyS-residuen7. De ratiometrische eigenschap van roGFP biedt betrouwbare redoxmetingen voor...

Oxidatieve stress werd gedefinieerd in 1985 door Helmut Sies als "een verstoring in prooxidant-antioxidant evenwicht ten gunste van de eerste"1, en een overvloed aan onderzoek is uitgevoerd om ziekte-, voeding-, en veroudering-specifieke redox status van organismen1,2,3te verkrijgen . Sindsdien is het begrip van oxidatieve stress breder geworden. Het testen van de hypothesen van het gebruik van antioxidanten tegen ziekten en/of veroudering heeft aangetoond dat oxidatieve stress niet alleen schade veroorzaakt, maar ook andere rollen in cellen heeft. Bovendien hebben wetenschappers aangetoond dat vrije radicalen een belangrijke rol spelen bij signaaltransductie2. Al deze studies versterken het belang van het bepalen van de veranderingen in de reductie-oxidatie (redox) verhouding van macromoleculen. Enzymactiviteit, antioxidanten en/of oxidanten en oxidatieproducten kunnen met verschillende methoden worden beoordeeld. Onder deze, methoden die thiol oxidatie te bepalen zijn misschien wel de meest gebruikte omdat ze rapporteren over de balans tussen antioxidanten en prooxidanten in cellen, evenals organismen4. Specifiek worden verhoudingen tussen glutathion (GSH)/glutathione disulfide (GSSG) en/of cysteïne (CyS)/cystine (CySS) gebruikt als biomarkers voor het monitoren van de redoxstatus van organismen2.
Methoden die worden gebruikt voor het testen van de balans tussen prooxidanten en antioxidanten zijn voornamelijk afhankelijk van de niveaus van verminderde / geoxideerde eiwitten of kleine moleculen in cellen. Westerse vlekken en massaspectrometrie worden gebruikt om de verhoudingen van verminderde/geoxideerde macromoleculen (eiwit, lipiden enz.) breed te beoordelen, en GSH/GSSG-verhoudingen kunnen worden beoordeeld met spectrofotometrie5. Een gemeenschappelijk kenmerk van deze methoden is de fysieke verstoring van het systeem door cellyse en/of weefselhomogenisatie. Deze analyses worden ook uitdagend wanneer het nodig is om de oxidatiestatus van verschillende cellulaire compartimenten te meten. Al deze verstoringen veroorzaken artefacten in de testomgeving.
Redox-gevoelige fluorescerende eiwitten openden een gunstig tijdperk voor het evalueren van de redoxbalans zonder een verstoring in de cellen6te veroorzaken. Ze kunnen zich richten op verschillende intracellulaire compartimenten, waardoor de kwantificering van compartimentspecifieke activiteiten (bijvoorbeeld de redoxtoestand van mitochondriën en de cytosol) kan worden geflankeerd om kruisspraak tussen cellulaire organellen te onderzoeken. Geel fluorescerend eiwit (YFP), groen fluorescerend eiwit (GFP) en HyPeR-eiwitten worden beoordeeld door Meyer en collega's6. Onder deze eiwitten is redox-gevoelige GFP (roGFP) uniek vanwege verschillende fluorescerende uitlezingen van zijn CyS (ex. 488 nm/em. 525 nm) en CySS (ex. 405 nm/525 nm) residuen, waardoor ratiometrische analyse mogelijk is, in tegenstelling tot andere redoxgevoelige eiwitten zoals YFP7,8. Ratiometrische output is waardevol omdat het een tegenwicht biedt aan de verschillen tussen expressieniveaus, detectiegevoeligheden en photobleaching8. Subcellulaire compartimenten van cellen (cytosol, mitochondriën, kern) of verschillende organismen (bacteriën en zoogdiercellen) kunnen worden gericht door roGFP7,9,10te wijzigen .
roGFP-testen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende beeldvormingstechnieken, vooral voor real-time visualisatie-experimenten. Flow cytometrische analyses van roGFP's zijn ook mogelijk voor experimenten met vooraf bepaalde tijdstippen. Het huidige artikel beschrijft zowel het gebruik van fluorescerende microscopie als stroomcytometrie om een ratiometrische beoordeling van de redox-toestand in zoogdiercellen uit te voeren die roGFP (gericht op cytosol) via adenovirale transductie overpreiden.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco by Life Sciences</td><td>25200-056</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>4-well chamber slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>154526</td><td>Celaanplantingsmateriaal voor fluorescente beeldvorming</td></tr><tr><td>5 ml buizen met celstrainerkap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Buis voor enkele celsuspensie voor flowcytometrieanalyse</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>Celaanplantingsmateriaal voor flowcytometrieanalyse</td></tr><tr><td>15 ml conische buizen</td><td>MidSci</td><td>C15B</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>75 cm2 geventileerde kapweefselkweekflessen</td><td>Corning</td><td>4306414</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Adenoviral cytosol specifiek roGFP</td><td>ViraQuest</td><td>VQAd roGFP</td><td>roGFP construct vriendelijk verstrekt door Dr. Schumaker</td></tr><tr><td>Klasse II, Type A2 Veiligheidskapkast</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Countess geautomatiseerde celteller</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>Celtelling</td></tr><tr><td>Countess celteller kamerslides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Celtelling</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco by Life Sciences</td><td>11995-065</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Gefilterde pipettentips, steriele, 20 &micro;l</td><td>Fisherbrand</td><td>02-717-161</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Gefilterde pipettentips, steriele, 1000 &micro;l</td><td>Fisherbrand</td><td>02-717-166</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>LSRFortessa</td><td>Instrument uitgerust met FITC en BV510 bandpass filters voor flowcytometrieanalyses</td></tr><tr><td>Fluorescente Microscoop</td><td>Advanced Microscopy Group (AMG)</td><td>Evos FL</td><td>Fluorescente beeldvorming</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>Positieve controle</td></tr><tr><td>Light Cube, Aangepast</td><td>Life Sciences</td><td>CUB0037</td><td>Fluorescente beeldvorming van roGFP expresserende cellen (ex 405 nm)</td></tr><tr><td>Light Cube, GFP</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMEP4651</td><td>Fluorescente beeldvorming van roGFP expresserende cellen (ex 488 nm)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>American Tissue Culture Collection</td><td>HTB-26</td><td>Menselijke epitheliale borstkankercellijn</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen, 2 ml</td><td>Grenier Bio-One</td><td>623201</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco by Life Sciences</td><td>10010-023</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Pipetregelaar</td><td>Drummond</td><td>Hood Mate Model 360</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Serologische pipet, 1 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11B</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Serologische pipet, 5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Serologische pipet, 10 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Weefselkweekincubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERACell 150i</td><td>CO2 incubator voor celcultuur</td></tr><tr><td>Trypan blauw kleurmiddel 0.4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Celtelling</td></tr></tbody></table>

beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Het meten van de intracellulaire oxidatie/reductiebalans geeft een overzicht van de fysiologische en/of pathofysiologische redox-status van een organisme. Thiolen zijn vooral belangrijk voor het verlichten van de redox-status van cellen via hun verminderde dithiol en geoxideerde disulfide ratio's. Engineered cysteïne-bevattende fluorescerende eiwitten openen een nieuw tijdperk voor redox-gevoelige biosensoren. Een van hen, redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten (roGFP), kan gemakkelijk worden geïntroduceerd in cellen met adenovirale transductie, waardoor de redox-status van subcellulaire compartimenten kunnen worden geëvalueerd zonder cellulaire processen te verstoren. Verminderde cysteines en geoxideerde cystines van roGFP hebben excitatie maxima op respectievelijk 488 nm en 405 nm, met emissie op 525 nm. Door de verhoudingen van deze verlaagde en geoxideerde vormen te beoordelen, kan de balans van redox in de cel gemakkelijk worden berekend. In deze methode artikel, vereeuwigd menselijke drievoudige negatieve borstkankercellen (MDA-MB-231) werden gebruikt om redox status te beoordelen binnen de levende cel. De protocolstappen omvatten MDA-MB-231 cellijntransductie met adenovirus om cytosolische roGFP uit te drukken, behandeling met H2O2, en beoordeling van cysteïne en cystineverhouding met zowel stroomcytometrie als fluorescentiemicroscopie.

De redoxtoestand van CyS/CySS is gemakkelijk te testen met getransduceerde roGFP's. De fluorescerende sonde kwantificeert de verhouding tussen de verlaagde en geoxideerde vormen (excitatiegolflengten respectievelijk 488 nm en 405 nm). Fluorescentie gegevens kunnen worden verkregen door zowel flow cytometrie en microscopie.
Een groot aantal cellen kan consequent en gemakkelijk worden verkregen met behulp van stroom cytometrie. De analyse bestaat uit 3 hoofdstappen: 1) selecteer de celpopulatie ...

Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.

Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Huidige protocolbeoordelaars in textiel, redox toestand veranderingen in een intracellulaire compartiment-specifieke manier. Ons protocol maakt een beter begrip en monitoring van alle fysiologische of pathofysiologische mechanismen van oxidatieve stress mogelijk. Deze techniek maakt het mogelijk om de betegelde verhouding van het oogsulfide in intacte cellen niet-verstorend te kwantificeren met behulp van een ratiometrische output om de verschillen tussen signaalexpressieniveaus, fotobleektechnologie en detectiegevoeligheden te compenseren.Dit protocol kan worden toegepast op verschillende organismen, waaronder bacteriën in planten. Op dag één van het experiment behandelen de cellen van een confluent borstkankercellijn gedurende twee minuten, met twee milliliter van 0,2, 5%-trips in EDTA. Wanneer de cellen beginnen te los arrestatie de reactie met zes milliliter van volledig medium en sediment de cellen door centrifugatie.Stel de pellet opnieuw op in vijf milliliter vers, compleet medium, tel de cellen en verdun ze tot 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per één milliliter compleet medium. Dan zaad 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter cellen per put in een 6 put plaat, en incubeer de cellen in de celcultuur incubator 's nachts. Of voeg geen virale rij GFP transductie.De volgende ochtend, voeg 12,5, 25, en 50 microliter van een een tot 100 verdund zes keer 10 aan de 10e plaque vormen eenheden per milliliter van voeg geen virale gfp-oplossing, in compleet medium. Voeg dat toe aan de juiste putten of de 6 putplaat om de cellen met respectievelijk 50, 100 en 200 multiplicities van infectie om te leiden. Wanneer alle van het monster Putten zijn getransduceerd met virus, de cellen terug te keren naar de cel cultuur incubator voor 16 tot 24 uur.De volgende dag visualiseren de cellen door fluorescentie microscopie en verving de supernatant met medium, zonder virus om de cellen te herstellen voor een extra 24 uur. Om de optimale transductie-efficiëntie te bepalen, beoordeelt u de fluorescentieintensiteit en morfologie van de cellen door stromingscytometrie. Zorg ervoor dat u alle procedures die infectie kunnen veroorzaken door aerosolen of spatten binnen een bioveiligheid niveau twee gecertificeerde biologische veiligheid kabinet uit te voeren.Om de redoxstatus van de cellen te beoordelen, broeden de cellen en de juiste putten van de 6 putplaat gedurende een uur met 10 micromolar waterstofperoxide uit, voordat de cellen worden losgemaakt met 750 microliter van 0,2 5%druppels in EDTA per put, zoals aangetoond. Stop de reactie met twee milliliter van volledig medium per put en trek de supernatants voor elke aandoening in individuele 15 milliliter conische buizen. Sediment de cellen door centrifugatie en was de pellets in 500 microliters van PBS per put door centrifugaties twee keer.Na de tweede wasbeurt, filter de cel schorsingen door 40 micro meter mazen in flow cytometrie compatibele buizen op ijs, beschermd tegen licht. In de Flow cytometer software, voer de nul multipliciteit van infectie controle monster. Analyseer vervolgens de waterstofperoxide en onbehandelde cellen.Hiermee kan de gemiddelde fluorescerende intensiteitsverhouding tussen de geoxideerde versus gereduceerde vormen van rijGFP worden berekend, met behulp van de formule zoals aangegeven. Hier zijn de gating strategie voor het selecteren van een groot aantal cellen door flow cytometrie wordt getoond. Flow cytometrie kan ook worden gebruikt om de dosis respons curve voor rij GFP-analyse en de meest efficiënte veelheid van infectie input te bepalen.Volgens de veelheid van infectie, dosis respons curve in deze representatieve analyse, een 200 veelheid van infectie gaf de hoogste weg GFP expressie, maar de cel morfologie werd uitgevoerd suggereert cytotoxiciteit. Daarom werd de optimale transductie-efficiëntie vastgesteld op een veelheid van infectie van 100. In deze redox status analyse, geoxideerd en verminderde rij GFP gemiddelde fluorescentie intensiteiten werden verkregen uit flow cytometrie analyse voor voertuig en vier 10 micromolar positieve controle waterstofperoxide behandelingen.De bedekte histogrammen vertegenwoordigen de verschuivingen in het celnummer in de 10 micromolar waterstofperoxide en voertuig behandelde groepen of verminderd en geoxideerd eroderen GFP. Berekening van de verhouding tussen de geoxideerde en verminderde rij GFP voor deze analyse bleek dat 10 micromolar waterstofperoxide veroorzaakt een drievoudige toename van oxidatie van rij GFP in vergelijking met de behandeling van het voertuig. Het hebben van nauwkeurige celnummers is belangrijk voor MRI-berekeningen en reproduceerbaarheid.Om reproduceerbare resultaten te hebben, moeten onderzoekers de antivirale oplossingen grondig mengen om homogene suspensies te verkrijgen. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om snelle redoxveranderingen te bestuderen als een integraal onderdeel van het brede scala van normale cellulaire processen en van ziekteprogressie in real time.

assessment-cellular-oxidation-using-subcellular-compartment-specific

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes the technique of visualizing oxidative stress in cultured organoids. This work helps in understanding the level of oxidative stress due to ROS accumulation in the various cell types present in an organoid after treatment with different ROS modulators.

Fluorescent Probe Imaging Assay: A Technique to Visualize Oxidative Stress in the Reactive Oxygen Species Inducer-Treated Cultured Intestinal Organoid Cells

We beschrijven het gebruik van twee ratiometrische, genetisch gecodeerd biosensoren, die zijn gebaseerd op GFP, om mitochondriale redox staat en ATP-spiegels te controleren bij subcellulaire resolutie in levende gistcellen.

Ratiometrische Biosensoren dat mitochondriaal Redox Staat en ATP Meet in Living gistcellen

Confocale scanning microscopie wordt toegepast voor beeldvorming enkele mitochondriale gebeurtenissen in doorbloed hart of skeletspieren in levende dieren. Real-time monitoring van enkele mitochondriale processen zoals superoxide flitsen en membraanpotentiaal schommelingen kan de evaluatie van de mitochondriale functie in een fysiologisch relevante context en tijdens pathologische verstoringen.

Confocale beeldvorming van Single mitochondriaal superoxide Knippert Intact Heart of In Vivo

Hier rapporteren we een protocol om oxidatieve stress in levende zebravisembryo's te meten. Deze procedure maakt de detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) mogelijk in zowel volledige embryoweefsels als enkele-celpopulaties. Dit protocol zal zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses mogelijk maken.

Analyse van oxidatieve stress in zebravis embryo&#39;s

In dit artikel wordt een microscopie-werkstroom voor hoge inhoud voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus aangeboden, evenals mitochondriale membraanpotentiaal en morfologie - gezamenlijk aangeduid als mitochondriale morfofunctie - in levend aanhechtende cellen met behulp van de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen 5- (en- 6) -chloormethyl-2 ', 7'-dichloordihydrofluoresceendiacetaat, acetylester (CM-H2 DCFDA) en tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy

Dit manuscript beschrijft het gebruik van genetisch-gecodeerde fluorogenic verslaggevers in een toepassing voor live-cel imaging voor de behandeling van xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. Deze experimentele aanpak biedt ongeëvenaarde Spatio resolutie, gevoeligheid en specificiteit terwijl het vermijden van veel van de tekortkomingen van conventionele methoden voor de detectie van toxicologische oxidatieve stress.

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

Hier presenteren we een protocol om de totale cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFH-DA). Deze methode kan cellulaire ROS lokalisatie visualiseren in aanhangende cellen met een fluorescentiemicroscoop en ros intensiteit kwantificeren met een fluorescentieplaatlezer. Dit protocol is eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief.

Detectie van totale reactieve zuurstofsoorten in aanhangende cellen door 2',7'-Dichloododihydrofluorescein Diacetate Kleuring

Dit protocol beschrijft het gebruik van een genetisch gecodeerd waterstofperoxide (H2O2)-biosensor in gekweekte zebravisneuronen en larven voor het beoordelen van de fysiologische signaleringsrollen van H2O2 tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Het kan worden toegepast op verschillende celtypen en worden aangepast met experimentele behandelingen om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de algemene ontwikkeling te bestuderen.

ROS Live Cell Imaging tijdens neuronale ontwikkeling

Het huidige protocol beschrijft een methode om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de intestinale muriene organoïden te detecteren met behulp van kwalitatieve beeldvorming en kwantitatieve cytometrie-assays. Dit werk kan mogelijk worden uitgebreid naar andere fluorescerende sondes om het effect van geselecteerde verbindingen op ROS te testen.

Analyse van oxidatieve stress in murine intestinale organoïden met behulp van reactieve zuurstof soortgevoelige fluorogene sonde

Dit artikel beschrijft een protocol om verschillen in basale redoxtoestand en redoxresponsen op acute verstoringen in primaire hippocampus- en corticale neuronen te bepalen met behulp van confocale levende microscopie. Het protocol kan met minimale aanpassingen worden toegepast op andere celtypen en microscopen.

Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator

Leer hoe je subcellulaire redoxstatus beoordeelt met redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten. Deze niet-disruptieve methode kwantificeert oxidatieve stress in intacte cellen voor celbiologisch onderzoek.

Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Meer video's verkennen