Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Huidige protocolbeoordelaars in textiel, redox toestand veranderingen in een intracellulaire compartiment-specifieke manier. Ons protocol maakt een beter begrip en monitoring van alle fysiologische of pathofysiologische mechanismen van oxidatieve stress mogelijk. Deze techniek maakt het mogelijk om de betegelde verhouding van het oogsulfide in intacte cellen niet-verstorend te kwantificeren met behulp van een ratiometrische output om de verschillen tussen signaalexpressieniveaus, fotobleektechnologie en detectiegevoeligheden te compenseren.

Dit protocol kan worden toegepast op verschillende organismen, waaronder bacteriën in planten. Op dag één van het experiment behandelen de cellen van een confluent borstkankercellijn gedurende twee minuten, met twee milliliter van 0,2, 5%-trips in EDTA. Wanneer de cellen beginnen te los arrestatie de reactie met zes milliliter van volledig medium en sediment de cellen door centrifugatie.

Stel de pellet opnieuw op in vijf milliliter vers, compleet medium, tel de cellen en verdun ze tot 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per één milliliter compleet medium. Dan zaad 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter cellen per put in een 6 put plaat, en incubeer de cellen in de celcultuur incubator 's nachts. Of voeg geen virale rij GFP transductie.

De volgende ochtend, voeg 12,5, 25, en 50 microliter van een een tot 100 verdund zes keer 10 aan de 10e plaque vormen eenheden per milliliter van voeg geen virale gfp-oplossing, in compleet medium. Voeg dat toe aan de juiste putten of de 6 putplaat om de cellen met respectievelijk 50, 100 en 200 multiplicities van infectie om te leiden. Wanneer alle van het monster Putten zijn getransduceerd met virus, de cellen terug te keren naar de cel cultuur incubator voor 16 tot 24 uur.

De volgende dag visualiseren de cellen door fluorescentie microscopie en verving de supernatant met medium, zonder virus om de cellen te herstellen voor een extra 24 uur. Om de optimale transductie-efficiëntie te bepalen, beoordeelt u de fluorescentieintensiteit en morfologie van de cellen door stromingscytometrie. Zorg ervoor dat u alle procedures die infectie kunnen veroorzaken door aerosolen of spatten binnen een bioveiligheid niveau twee gecertificeerde biologische veiligheid kabinet uit te voeren.

Om de redoxstatus van de cellen te beoordelen, broeden de cellen en de juiste putten van de 6 putplaat gedurende een uur met 10 micromolar waterstofperoxide uit, voordat de cellen worden losgemaakt met 750 microliter van 0,2 5%druppels in EDTA per put, zoals aangetoond. Stop de reactie met twee milliliter van volledig medium per put en trek de supernatants voor elke aandoening in individuele 15 milliliter conische buizen. Sediment de cellen door centrifugatie en was de pellets in 500 microliters van PBS per put door centrifugaties twee keer.

Na de tweede wasbeurt, filter de cel schorsingen door 40 micro meter mazen in flow cytometrie compatibele buizen op ijs, beschermd tegen licht. In de Flow cytometer software, voer de nul multipliciteit van infectie controle monster. Analyseer vervolgens de waterstofperoxide en onbehandelde cellen.

Hiermee kan de gemiddelde fluorescerende intensiteitsverhouding tussen de geoxideerde versus gereduceerde vormen van rijGFP worden berekend, met behulp van de formule zoals aangegeven. Hier zijn de gating strategie voor het selecteren van een groot aantal cellen door flow cytometrie wordt getoond. Flow cytometrie kan ook worden gebruikt om de dosis respons curve voor rij GFP-analyse en de meest efficiënte veelheid van infectie input te bepalen.

Volgens de veelheid van infectie, dosis respons curve in deze representatieve analyse, een 200 veelheid van infectie gaf de hoogste weg GFP expressie, maar de cel morfologie werd uitgevoerd suggereert cytotoxiciteit. Daarom werd de optimale transductie-efficiëntie vastgesteld op een veelheid van infectie van 100. In deze redox status analyse, geoxideerd en verminderde rij GFP gemiddelde fluorescentie intensiteiten werden verkregen uit flow cytometrie analyse voor voertuig en vier 10 micromolar positieve controle waterstofperoxide behandelingen.

De bedekte histogrammen vertegenwoordigen de verschuivingen in het celnummer in de 10 micromolar waterstofperoxide en voertuig behandelde groepen of verminderd en geoxideerd eroderen GFP. Berekening van de verhouding tussen de geoxideerde en verminderde rij GFP voor deze analyse bleek dat 10 micromolar waterstofperoxide veroorzaakt een drievoudige toename van oxidatie van rij GFP in vergelijking met de behandeling van het voertuig. Het hebben van nauwkeurige celnummers is belangrijk voor MRI-berekeningen en reproduceerbaarheid.

Om reproduceerbare resultaten te hebben, moeten onderzoekers de antivirale oplossingen grondig mengen om homogene suspensies te verkrijgen. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om snelle redoxveranderingen te bestuderen als een integraal onderdeel van het brede scala van normale cellulaire processen en van ziekteprogressie in real time.