Op papier gebaseerde preconcentratie en isolatie van microvesicles en exosomen

In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode om een op papier gebaseerd apparaat genaamd de XO Pad te fabriceren, dat is ontworpen voor de effectieve verrijking in isolatie van extracellulaire vikjes. De XO Pad is een eenvoudig apparaat dat extracellulaire blaasjes kan voorconcentraat en isoleren zonder het gebruik van chemicaliën of werkmachines, terwijl ze hogere terugwinningspercentages kunnen vertonen dan conventionele methoden. Begin met het definiëren van de regio die moet worden afgedrukt met printersoftware.

Het ontwerp moet 12 lagen met waspatroon hebben waarin de diameters van de cirkelvormige monstergebieden geleidelijk worden verkleind van vijf tot twee millimeter. Druk vervolgens hydrofobe was af op de aangewezen gebieden aan beide zijden van het cellulosepapier. Plaats het waspapier 80 seconden in een laboratoriumoven op 120 graden Celsius en snijd vervolgens het wasgeprinte papier met een frees om individuele XO Pad-apparaten te maken.

Drop een vijf en twee microliter van permanent selectief mem op de monstergebieden in de linker meeste en rechts de meeste lagen, respectievelijk. Plaats de lagen gecodeerd met de permanent selectief mem op een hete plaat op 70 graden Celsius gedurende 30 minuten om het oplosmiddel te verdampen. Sluit vervolgens het buitenste oppervlak van de gecoate laag naar de bufferoplossing af met drukgevoelige tape, waardoor een klein gaatje overblijft.

Vouw het XO Pad-apparaat heen en weer langs de witte lijnen om alle monstergebieden convergent met elkaar te verbinden. Pipette 15 microliters van de microvesicle en exosoom monster in de convergente monster gebieden en wacht een paar seconden om volledige bevochtiging te garanderen. Plaats twee acrylkamers aan beide uiteinden van de XO Pad en klem deze stevig met kleine bindmiddelclips om ontvouwen te voorkomen.

Vul de kamers met 110 microliter van 0,1X PBS en steek twee zilveren elektroden in. Gebruik vervolgens een stroomspanningsbronmeetsysteem om 30 volt gedurende 20 minuten op de elektroden aan te brengen. Om de verrijkte microvesicles en exosomen te isoleren, scheidt u de gevouwen XO Pad van de acrylkamers en vouwt u het apparaat uit om de verrijkte deeltjes van de andere lagen te isoleren.

Punch uit de steekproef gebieden in lagen acht en negen waar de microvesicles en exosomen zijn verrijkt voor downstream-analyse. Een time-lapse migratietest van fluorescerend gelabelde microvesicles en exosomen werd uitgevoerd om de werkingstijd voor een maximaal herstel van de verrijkte deeltjes te optimaliseren. De fluorescentieintensiteiten in alle steekproefgebieden werden gekwantificeerd met ImageJ-software.

Vóór het verrijkingsproces werden microvesicles en exosomen verspreid in alle monstergebieden met een geleidelijke afname van de intensiteit. Na 10 minuten verwerking migreerden de deeltjes elektro-kinetisch en verscheen er een onmiddellijke preconcentratieplug op laag zeven. Toen de tijd 20 minuten bereikte, waren microvesicles en exosomen sterk gericht op lagen acht en negen en verrijkten vijfvoudig op basis van de fluorescentieintensiteiten.

De integriteit van de verrijkte microvesicles en exosomen in laag acht werd onderzocht met SEM. Aanzienlijk meer niet-beschadigde deeltjes werden waargenomen na het verrijkingsproces. De grootteverdeling van de verrijkte microvesicles en exosomen werd ook geanalyseerd.

Vervolgens werd de werkelijke concentratie van de verrijkte microvesicles en exosomen op de monstergebieden in lagen zes, acht en 10 geanalyseerd. In laag acht werden de microvesicles en exosomen voorgeconcentreerd met een factor 5,58, maar in de andere lagen werd geen merkbare preconcentratie waargenomen. Om de reproduceerbaarheid van deze procedure te garanderen, volgt u precies het protocol voor de incubatietijd en temperatuur van de oven tijdens de verificatie van het apparaat en de werkingstijd van het apparaat, omdat dit de geoptimaliseerde omstandigheden zijn.

De XO Pad kan ook worden gebruikt om extracellulaire blaasjes te scheiden en te isoleren van eiwitrijke monsters, zoals serum of plasma, met behulp van carbonaatbuffer. Dit protocol kan een efficiënt, eenvoudig voorbereidingsinstrument bieden, met zijn pre-concentrerende en isolerende mogelijkheden die nodig zijn voor klinisch onderzoek, zoals diagnose, verlening van geneesmiddelen, immunotherapie en andere therapieën.