Name: Op papier gebaseerde preconcentratie en isolatie van microvesicles en exosomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Leer een papiergebaseerde methode voor preconcentratie en isolatie van microvesikels en exosomen met het XO Pad. Dit apparaat biedt hogere opbrengsten dan conventionele technieken zonder chemicaliën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444. J. H. Lee werd in 2019 ondersteund door een onderzoeksbeurs van de Universiteit van Kwangwoon. Hyerin Kim werd ondersteund door het "Competency Development Program for Industry Specialists" van het Koreaanse ministerie van Handel, Industrie en Energie (MOTIE), beheerd door het Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (nr. P0002397, HRD programma voor industriële convergentie van draagbare slimme apparaten).

1. Fabricage van het apparaat
<ol><li>Definieer de regio die op papier moet worden afgedrukt met behulp van printersoftware(Tabel met materialen). OPMERKING: Het ontwerp heeft 12 lagen met waspatroon waarin de diameters van de ronde monstergebieden geleidelijk worden verkleind van 5 mm tot 2 mm (figuur 1A).</li>
	<li>Druk hydrofobe was op de aangewezen gebieden aan beide zijden van het cellulosepapier(Tabel van materialen) af met behulp van een commerciële wasprinter (Tabel van materialen) ( figuur1B).</li>
	<li>Plaats het met was bedrukte papier in een laboratoriumoven voor 80 s bij 120 °C. LET OP: Met deze stap kan de was de binnenkant van het papier bereiken door een thermische reflow van de bedrukte was te bereiken. Met dit incubatieprotocol is de resolutie van het patroon ~2 mm. Dus, wees voorzichtig niet om patronen van minder dan 2 mm af te drukken. Anders worden de patronen geblokkeerd door de was.</li>
	<li>Snijd het met was bedrukte papier met een frees om afzonderlijke apparaten te maken (figuur 1C).</li>
	<li>Drop 5 μL en 2 μL permselective membraan (bijvoorbeeld Nafion; Materiaaltafel) op de monstergebieden in respectievelijk de meest linkse en meest rechtse lagen(figuur 1D).</li>
	<li>Plaats de lagen bedekt met het permselectieve membraan op een hete plaat op 70 °C gedurende 30 minuten om het permselectieve membraan oplosmiddel te verdampen.</li>
	<li>Verzegel het buitenste oppervlak van de gecoate laag naar de bufferoplossing met drukgevoelige tape, waardoor een klein gaatje overblijft.</li>
	<li>Vouw het geprinte individuele apparaat (d.w.z. Exo-PAD) heen en weer langs de witte lijnen. OPMERKING: Door het apparaat op te vouwen, worden alle monstergebieden convergent verbonden(figuur 1E). Dit convergente ontwerp richt zich op de elektrische veldlijnen wanneer de spanning wordt toegepast voor ICP, het bereiken van een intensievere preconcentratie van de microvesicles en exosomen.</li>
</ol>2. Verrijking en ruimtelijke scherpstelling van microvesicles en exosomen door polarisatie van de ionenconcentratie
<ol><li>Laad 15 μL van de microvesicle en exosoommonster (~3 x 1011 deeltjes/mL in 0,1x fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS] met 0,05% Tween 20) in de convergente monstergebieden door leiding te geven en wacht een paar seconden om volledige bevochtiging van alle monstergebieden te garanderen (figuur 1F).</li>
	<li>Plaats twee acrylkamers aan beide uiteinden van de Exo-PAD en klem de Exo-PAD stevig met kleine bindmiddelclips om ontvouwen te voorkomen(figuur 1G).</li>
	<li>Vul de kamers met 110 μL van 0,1x PBS en steek twee Ag/AgCl-elektroden in (figuur 1H).</li>
	<li>Breng 30 V gedurende 20 minuten aan op de elektroden met behulp van een stroom-voltagebronmeetsysteem(Tabel van materialen). OPMERKING: De toegepaste spanning genereert het ICP-fenomeen en concentreert daarom de microvesicles en exosomen op de lagen 8 en 9 van de Exo-PAD.</li>
</ol>3. Isolatie van de verrijkte microvesicles en exosomen
<ol><li>Scheid de gevouwen Exo-PAD van de acrylkamers en vouw het apparaat open om de verrijkte microvesicles en exosomen van de andere lagen te isoleren (figuur 1I).</li>
	<li>Punch uit de steekproef gebieden in de lagen 8 en 9, waar de microvesicles en exosomen zijn verrijkt, voor downstream-analyse (Figuur 1J).</li>
</ol>4. Scanning elektronenmicroscopie analyse
<ol><li>Bevestig de verrijkte microvesicles en exosomen door de geponste gebieden in 2,5% glutaraldehyde onder te dompelen in 0,1 M natriumcaanoodylaatbuffer voor 1 h en in 1% osmiumteroxide in 0,1 M natriumcaanolaat gedurende 1 uur. LET OP: Osmium tetroxide is zeer giftig en gevaarlijk chemisch. Omdat osmiumteroxide kunststoffen kan binnendringen, moet het in glas worden opgeslagen. Elke behandeling van osmium tetroxide moet worden uitgevoerd in een chemische rookkap met dubbele nitrilhandschoenen.</li>
	<li>Dehydrateren van de vaste microvesicles en exosomen met oplopende kwaliteiten van 200 bewijs ethanol (d.w.z. 50%, 70%, 90% en 100%) voor 30 min per stuk.</li>
	<li>Droog het monster chemisch door het 30 minuten in hexamethyldisilazane in een desiccator onder te dompelen. LET OP: Hexamethyldisilazane is een brandbare en vochtgevoelige chemische stof. Het moet worden opgeslagen in een droge en goed geventileerde ruimte uit de buurt van ontstekingsbronnen.</li>
	<li>Coat de volledig gedroogde microvesicles en exosomen met goud / palladium (~ 20 nm) via sputteren en vangen scanning elektronenmicroscopie (SEM) beelden.</li>
</ol>5. Nanodeelvolganalyse
<ol><li>Punch uit de steekproef gebieden in de lagen 6, 8 en 10 met behulp van een biopsie punch na 20 min van het apparaat operatie.</li>
	<li>Dompel elk uitgestakt gebied onder in bufferoplossing (0,1x PBS met 0,01% Tween 20).</li>
	<li>Vortex voor 10 min en centrifuge voor 30 s bij 6.000 rpm om de verrijkte microvesicles en exosomen opnieuw op te lichten.</li>
	<li>Verwijder de uitgeponst-out gebieden uit de oplossing en meet de concentratie van microvesicles en exosomen door middel van een nanoparticle tracking analysis (NTA) instrument(Table of Materials).</li>
</ol>

<ol><li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+%26+A%3A+What+are+exosomes%2C+exactly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Q & A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li>
<li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis%3A+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li>
<li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li>
<li>Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology%2C+pathophysiology%2C+and+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li>
<li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origami-paper-based+device+for+microvesicle%2Fexosome+preconcentration+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles%3A+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li>
<li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li>
<li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation%3A+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li>
<li>Chiriacò, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175(2018).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro%2Fnanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li>
<li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel de Exo-PAD met succes werd gebruikt voor de verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen, moeten verschillende kritieke punten zorgvuldig worden overwogen: 1) de incubatietijd en temperatuur van de oven tijdens de bereiding van het apparaat, 2) verwerkingstijd, 3) toepassing van spanning met verschillende laagnummers en diameters van het monstergebied, en 4) toepasselijkheid op klinische monsters.
De incubatietijd en temperatuur in het protocol zijn geoptimaliseerde omstandighed...

Microvesicles en exosomen zijn kleine membraanvezelpen van respectievelijk 0,2−1 μm en 30−200 nm. Ze worden afgescheiden in de extracellulaire omgeving door verschillende celtypen1,2,3,4,5. Ze bevatten ouderlijke cel informatie in de vorm van subsets van DNA, mRNA, miRNA, eiwitten, en lipiden, en circuleren door het hele lichaam via verschillende lichaamsvloeistoffen zoals serum, plasma, urine, hersenvocht, vruchtwater, en speeksel6,7,8,9. Zo kunnen technieken voor een efficiënte isolatie van microvesicles en exosomen van biologische vloeistoffen uitgebreide mogelijkheden bieden op het gebied van de diagnose, prognose en real-time monitoring van de ziekte, evenals in de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
De conventionele isolatiemethode voor microvesicles en exosomen op basis van ultracentrifugatie is echter uiterst tijdrovend en veroorzaakt aanzienlijk verlies en verontreiniging van het monster. Dit komt omdat het gaat om verschillende omslachtige pipetting en laadstappen en het weggooien van verschillende reagentia met herhaalde ultracentrifugatie5,6,10,11,12. Bovendien kan de hoge afschuifspanning veroorzaakt door ultracentrifugatie (~100.000 x g) de fysieke lyse van microvesicles en exosomen veroorzaken , wat een slechte herstelsnelheid oplevert (5−23%)6,13,14. Daarom moet een zeer efficiënte, onopvallende isolatietechniek voor microvesicles en exosomen worden ontwikkeld om schade en verlies te verminderen, waardoor hogere herstelsnelheden worden bereikt.
Een op origami-papier gebaseerd apparaat (Exo-PAD) is ontwikkeld voor een eenvoudigere, zachtere en zeer efficiënte isolatie van microvesicles en exosomen6. Het ontwerp van de Exo-PAD is een meervoudig papier met serieel verbonden monstergebieden die geleidelijk in diameter afnemen. De ionconcentratiepolarisatie (ICP) techniek, een nano-elektro-elektro-elektrokinetisch fenomeen dat geladen biomoleculen preconcentraeert, werd geïntegreerd met dit unieke ontwerp. Het gebruik van de Exo-PAD resulteerde in een vijfvoudige verrijking van de microvesicles en exosomen in specifieke lagen en hun isolatie door simpelweg het apparaat te ontvouwen. Dit artikel beschrijft de Exo-PAD in detail, van de algehele fabricage en werking van het apparaat tot de analyse van het gebruik ervan, om de methode te illustreren en representatieve resultaten weer te geven6.

<table><tbody><tr><td>Ag/AgCl-elektroden</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>531500</td><td>0,15" diameter</td></tr><tr><td>Albumine uit runderserum (BSA), Alexa Fluor 594-conjugaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13101</td><td>BSA geconjugeerd met Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td></tr><tr><td>Carbonaat-bicarbonaatbuffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041-50CAP</td><td>Carbonaatbuffer</td></tr><tr><td>CorelDraw-software (Coral Co., Canada)</td><td>Corel Corporation</td><td></td><td>Printersoftware om het wasafdrukgebied te definiëren</td></tr><tr><td>ColorQube 8870</td><td>Xerox Corporation</td><td></td><td>Wasprinter</td></tr><tr><td>Chromatografiepapier graad 1</td><td>Whatman</td><td>3001-861</td><td>Cellulosepapier, afmeting: 20 * 20 cm</td></tr><tr><td>Fluorescent gelabelde exosome-standaarden</td><td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td><td>HBM-F-PEP-100</td><td>Exosoom gelabeld met FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td></tr><tr><td>Keithley 2410 stroom-/spanningsbron-meter</td><td>Keithley Instruments, Inc.</td><td></td><td>Stroom-spanningsbron meetsysteem</td></tr><tr><td>Nafion perfluorineerde harsoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31175-20-9</td><td>Permselectieve membraan, 20 wt.% in het mengsel van lagere alifatische alcoholen en water; bevat 34% water</td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Technology</td><td></td><td>Nanodeeltjetrackinganalyse (NTA) machine</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferd serum (PBS, pH7,4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010001</td><td></td></tr></tbody></table>

op papier gebaseerde preconcentratie en isolatie van microvesicles en exosomen

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Microvesicles en exosomen zijn kleine membranous vesicles vrijgegeven aan de extracellulaire omgeving en verspreid door het hele lichaam. Omdat ze verschillende door ouderlijke cellen afgeleide biomoleculen bevatten, zoals DNA, mRNA, miRNA, eiwitten en lipiden, zijn hun verrijking en isolatie cruciale stappen voor hun exploitatie als potentiële biomarkers voor klinische toepassingen. Conventionele isolatiemethoden (bijvoorbeeld ultracentrifugatie) veroorzaken echter aanzienlijk verlies en schade aan microvesicles en exosomen. Deze methoden vereisen ook meerdere repetitieve stappen van ultracentrifugatie, laden en verspillen van reagentia. Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methode om een op origamipapier gebaseerd apparaat (Exo-PAD) te fabriceren dat is ontworpen voor de effectieve verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen op een eenvoudige manier. Het unieke ontwerp van de Exo-PAD, bestaande uit accordeonachtige multifolded lagen met convergente monstergebieden, is geïntegreerd met de ionconcentratiepolarisatietechniek, waardoor de microvesicles en exosomen op specifieke lagen vervijfvoudigd kunnen worden. Bovendien worden de verrijkte microvesicles en exosomen geïsoleerd door simpelweg de Exo-PAD uit te vouwen.

De bedrijfstijd moet worden geoptimaliseerd om de maximale herstelopbrengst van de verrijkte microvesicles en exosomen te bereiken. Onvoldoende tijd maakt onvoldoende migratie van de microvesicles en exosomen mogelijk, waardoor de verrijking afneemt, terwijl overmatige tijd de ruimtelijke scherpstelling verslechtert en dus de microvesicles en exosomen verspreidt. Zo kan door de tijdoptimalisatiestap de maximale preconcentratiefactor van microvesicles en exosomen en de uiteindelijke locatie waar microvesicles en exosomen ...

Gepresenteerd is een protocol om een op papier gebaseerd apparaat te fabriceren voor de effectieve verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen.

Op papier gebaseerde preconcentratie en isolatie van microvesicles en exosomen

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode om een op papier gebaseerd apparaat genaamd de XO Pad te fabriceren, dat is ontworpen voor de effectieve verrijking in isolatie van extracellulaire vikjes. De XO Pad is een eenvoudig apparaat dat extracellulaire blaasjes kan voorconcentraat en isoleren zonder het gebruik van chemicaliën of werkmachines, terwijl ze hogere terugwinningspercentages kunnen vertonen dan conventionele methoden. Begin met het definiëren van de regio die moet worden afgedrukt met printersoftware.Het ontwerp moet 12 lagen met waspatroon hebben waarin de diameters van de cirkelvormige monstergebieden geleidelijk worden verkleind van vijf tot twee millimeter. Druk vervolgens hydrofobe was af op de aangewezen gebieden aan beide zijden van het cellulosepapier. Plaats het waspapier 80 seconden in een laboratoriumoven op 120 graden Celsius en snijd vervolgens het wasgeprinte papier met een frees om individuele XO Pad-apparaten te maken.Drop een vijf en twee microliter van permanent selectief mem op de monstergebieden in de linker meeste en rechts de meeste lagen, respectievelijk. Plaats de lagen gecodeerd met de permanent selectief mem op een hete plaat op 70 graden Celsius gedurende 30 minuten om het oplosmiddel te verdampen. Sluit vervolgens het buitenste oppervlak van de gecoate laag naar de bufferoplossing af met drukgevoelige tape, waardoor een klein gaatje overblijft.Vouw het XO Pad-apparaat heen en weer langs de witte lijnen om alle monstergebieden convergent met elkaar te verbinden. Pipette 15 microliters van de microvesicle en exosoom monster in de convergente monster gebieden en wacht een paar seconden om volledige bevochtiging te garanderen. Plaats twee acrylkamers aan beide uiteinden van de XO Pad en klem deze stevig met kleine bindmiddelclips om ontvouwen te voorkomen.Vul de kamers met 110 microliter van 0,1X PBS en steek twee zilveren elektroden in. Gebruik vervolgens een stroomspanningsbronmeetsysteem om 30 volt gedurende 20 minuten op de elektroden aan te brengen. Om de verrijkte microvesicles en exosomen te isoleren, scheidt u de gevouwen XO Pad van de acrylkamers en vouwt u het apparaat uit om de verrijkte deeltjes van de andere lagen te isoleren.Punch uit de steekproef gebieden in lagen acht en negen waar de microvesicles en exosomen zijn verrijkt voor downstream-analyse. Een time-lapse migratietest van fluorescerend gelabelde microvesicles en exosomen werd uitgevoerd om de werkingstijd voor een maximaal herstel van de verrijkte deeltjes te optimaliseren. De fluorescentieintensiteiten in alle steekproefgebieden werden gekwantificeerd met ImageJ-software.Vóór het verrijkingsproces werden microvesicles en exosomen verspreid in alle monstergebieden met een geleidelijke afname van de intensiteit. Na 10 minuten verwerking migreerden de deeltjes elektro-kinetisch en verscheen er een onmiddellijke preconcentratieplug op laag zeven. Toen de tijd 20 minuten bereikte, waren microvesicles en exosomen sterk gericht op lagen acht en negen en verrijkten vijfvoudig op basis van de fluorescentieintensiteiten.De integriteit van de verrijkte microvesicles en exosomen in laag acht werd onderzocht met SEM. Aanzienlijk meer niet-beschadigde deeltjes werden waargenomen na het verrijkingsproces. De grootteverdeling van de verrijkte microvesicles en exosomen werd ook geanalyseerd.Vervolgens werd de werkelijke concentratie van de verrijkte microvesicles en exosomen op de monstergebieden in lagen zes, acht en 10 geanalyseerd. In laag acht werden de microvesicles en exosomen voorgeconcentreerd met een factor 5,58, maar in de andere lagen werd geen merkbare preconcentratie waargenomen. Om de reproduceerbaarheid van deze procedure te garanderen, volgt u precies het protocol voor de incubatietijd en temperatuur van de oven tijdens de verificatie van het apparaat en de werkingstijd van het apparaat, omdat dit de geoptimaliseerde omstandigheden zijn.De XO Pad kan ook worden gebruikt om extracellulaire blaasjes te scheiden en te isoleren van eiwitrijke monsters, zoals serum of plasma, met behulp van carbonaatbuffer. Dit protocol kan een efficiënt, eenvoudig voorbereidingsinstrument bieden, met zijn pre-concentrerende en isolerende mogelijkheden die nodig zijn voor klinisch onderzoek, zoals diagnose, verlening van geneesmiddelen, immunotherapie en andere therapieën.

paper-based-preconcentration-isolation-microvesicles

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Deze paper toont voor de isolering, zuivering en detectie van exosomes, evenals technieken voor de analyse van hun moleculaire inhoud. Deze methoden zijn aanpasbaar voor exosome isolatie van zowel de media voor celkweek en biologische vloeistoffen, en kan daarna analyse van moleculaire content ook nuttig zijn in functionele studies.

Isolatie en karakterisatie van RNA-bevattende Exosomes

Dit protocol Gegevens methode extracellulaire blaasjes (EV), kleine membraneuze deeltjes vrijgemaakt uit cellen te isoleren, van slechts 10 pl serummonsters. Deze benadering omzeilt de noodzaak van ultracentrifugatie, vereist slechts enkele minuten testtijd en maakt de isolatie van EV uit monsters van beperkte omvang.

Papieren Inrichtingen voor isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes

Galvocht is een waardevolle bron van extracellulaire vesiclen/exosomen die potentieel belangrijke biomarkers bevatten. Dit protocol vertegenwoordigt een robuuste methode om exosomen uit menselijk gal te isoleren voor verdere analyses, inclusief miRNA-profilering.

Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

Extracellulaire vesicules in bloed zijn voorgesteld als nieuwe biomarkers voor verschillende ziekten. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van grote plasmamembraan-afgeleide microvesicles uit perifere bloedmonsters en hun daaropvolgende analyse door conventionele flowcytometrie en Western Blotting.

Isolatie en karakterisering van microvesicles uit perifeer bloed

Hier presenteren we een protocol om te zuiveren van exosomes van plasma en serum met verminderde CO zuivering van niet-exosomal bloedeiwitten. Het geoptimaliseerde protocol bevat ultrafiltratie, protease behandeling en grootte uitsluiting chromatografie. Verbeterde zuivering van exosomes voordelen downstream analyses, met inbegrip van nauwkeuriger kwantificering van blaasjes en proteomic karakterisering.

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Dit is een protocol om weefsel extracellulaire blaasjes (EVs) te isoleren van de lever. Het protocol beschrijft een proces in twee stappen waarbij Collagenase perfusie gevolgd door differentiële ultracentrifugatie om leverweefsel EVs te isoleren.

Isolatie van weefsel extracellulaire vesicles uit de lever

Dit protocol isoleert extracellulaire blaasjes (Ev's) uit de buurt van virionen met hoge efficiëntie en opbrengst door het opnemen van EV-neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en deeltjes opname om een gestroomlijnde workflow en een reductie van start volume vereisten, resulterend in reproduceerbare preparaten voor gebruik in alle EV-onderzoek.

Zuivering van extracellulaire vesikel preparaten met hoge opbrengst uit de buurt van het virus

Dit protocol laat zien hoe de kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) van menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd met een eenvoudige benchtop-instelling op laboratoriumschaal. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, sEV-markers en morfologie van geïsoleerde hUC-MSC-sEV's worden gekenmerkt door respectievelijk nanodeeltjestrackinganalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop.

Een eenvoudige benchtop-filtratiemethode om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren van menselijke mesenchymale stamcellen

Dit protocol biedt een snelle en groottespecifieke isolatiemethode voor kleine extracellulaire blaasjes door de grootte van de luchtsproeikop te optimaliseren, de druk van de mantelvloeistof, de druk van de monsterstroom, de spanning, versterking en triggerdrempelparameters.

Optimalisatie van flowcytometrische sorteerparameters voor isolatie met hoge doorvoer en zuivering van kleine extracellulaire blaasjes

Extracellulaire blaasjes zijn veelbelovend voor biomedische toepassingen, maar de huidige isolatiemethoden zijn tijdrovend en onpraktisch voor klinisch gebruik. In deze studie presenteren we een microfluïdisch apparaat dat de directe isolatie van extracellulaire blaasjes uit grote hoeveelheden biovloeistoffen op een continue manier met minimale stappen mogelijk maakt.

Isolatie in één stap van extracellulaire blaasjes uit monsters met een groot volume met een gespleten A4F-microfluïdisch apparaat

Dit protocol beschrijft de isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg met behulp van enzymatische vertering en grootte-uitsluitingschromatografie, waardoor reproduceerbare terugwinning van vesikelverrijkte fracties uit structureel complexe, laagopbrengstweefsels mogelijk is voor downstream moleculaire analyse.

Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg door grootte-uitsluitingschromatografie

Leer een papiergebaseerde methode voor preconcentratie en isolatie van microvesikels en exosomen met het XO Pad. Dit apparaat biedt hogere opbrengsten dan conventionele technieken zonder chemicaliën.

Op papier gebaseerde preconcentratie en isolatie van microvesicles en exosomen

Meer video's verkennen