Op papier gebaseerde preconcentratie en isolatie van microvesicles en exosomen
29 april 2020
Gepresenteerd is een protocol om een op papier gebaseerd apparaat te fabriceren voor de effectieve verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen.
In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode om een op papier gebaseerd apparaat genaamd de XO Pad te fabriceren, dat is ontworpen voor de effectieve verrijking in isolatie van extracellulaire vikjes. De XO Pad is een eenvoudig apparaat dat extracellulaire blaasjes kan voorconcentraat en isoleren zonder het gebruik van chemicaliën of werkmachines, terwijl ze hogere terugwinningspercentages kunnen vertonen dan conventionele methoden. Begin met het definiëren van de regio die moet worden afgedrukt met printersoftware.
Het ontwerp moet 12 lagen met waspatroon hebben waarin de diameters van de cirkelvormige monstergebieden geleidelijk worden verkleind van vijf tot twee millimeter. Druk vervolgens hydrofobe was af op de aangewezen gebieden aan beide zijden van het cellulosepapier. Plaats het waspapier 80 seconden in een laboratoriumoven op 120 graden Celsius en snijd vervolgens het wasgeprinte papier met een frees om individuele XO Pad-apparaten te maken.
Drop een vijf en twee microliter van permanent selectief mem op de monstergebieden in de linker meeste en rechts de meeste lagen, respectievelijk. Plaats de lagen gecodeerd met de permanent selectief mem op een hete plaat op 70 graden Celsius gedurende 30 minuten om het oplosmiddel te verdampen. Sluit vervolgens het buitenste oppervlak van de gecoate laag naar de bufferoplossing af met drukgevoelige tape, waardoor een klein gaatje overblijft.
Vouw het XO Pad-apparaat heen en weer langs de witte lijnen om alle monstergebieden convergent met elkaar te verbinden. Pipette 15 microliters van de microvesicle en exosoom monster in de convergente monster gebieden en wacht een paar seconden om volledige bevochtiging te garanderen. Plaats twee acrylkamers aan beide uiteinden van de XO Pad en klem deze stevig met kleine bindmiddelclips om ontvouwen te voorkomen.
Vul de kamers met 110 microliter van 0,1X PBS en steek twee zilveren elektroden in. Gebruik vervolgens een stroomspanningsbronmeetsysteem om 30 volt gedurende 20 minuten op de elektroden aan te brengen. Om de verrijkte microvesicles en exosomen te isoleren, scheidt u de gevouwen XO Pad van de acrylkamers en vouwt u het apparaat uit om de verrijkte deeltjes van de andere lagen te isoleren.
Punch uit de steekproef gebieden in lagen acht en negen waar de microvesicles en exosomen zijn verrijkt voor downstream-analyse. Een time-lapse migratietest van fluorescerend gelabelde microvesicles en exosomen werd uitgevoerd om de werkingstijd voor een maximaal herstel van de verrijkte deeltjes te optimaliseren. De fluorescentieintensiteiten in alle steekproefgebieden werden gekwantificeerd met ImageJ-software.
Vóór het verrijkingsproces werden microvesicles en exosomen verspreid in alle monstergebieden met een geleidelijke afname van de intensiteit. Na 10 minuten verwerking migreerden de deeltjes elektro-kinetisch en verscheen er een onmiddellijke preconcentratieplug op laag zeven. Toen de tijd 20 minuten bereikte, waren microvesicles en exosomen sterk gericht op lagen acht en negen en verrijkten vijfvoudig op basis van de fluorescentieintensiteiten.
De integriteit van de verrijkte microvesicles en exosomen in laag acht werd onderzocht met SEM. Aanzienlijk meer niet-beschadigde deeltjes werden waargenomen na het verrijkingsproces. De grootteverdeling van de verrijkte microvesicles en exosomen werd ook geanalyseerd.
Vervolgens werd de werkelijke concentratie van de verrijkte microvesicles en exosomen op de monstergebieden in lagen zes, acht en 10 geanalyseerd. In laag acht werden de microvesicles en exosomen voorgeconcentreerd met een factor 5,58, maar in de andere lagen werd geen merkbare preconcentratie waargenomen. Om de reproduceerbaarheid van deze procedure te garanderen, volgt u precies het protocol voor de incubatietijd en temperatuur van de oven tijdens de verificatie van het apparaat en de werkingstijd van het apparaat, omdat dit de geoptimaliseerde omstandigheden zijn.
De XO Pad kan ook worden gebruikt om extracellulaire blaasjes te scheiden en te isoleren van eiwitrijke monsters, zoals serum of plasma, met behulp van carbonaatbuffer. Dit protocol kan een efficiënt, eenvoudig voorbereidingsinstrument bieden, met zijn pre-concentrerende en isolerende mogelijkheden die nodig zijn voor klinisch onderzoek, zoals diagnose, verlening van geneesmiddelen, immunotherapie en andere therapieën.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het fabriceren van een op papier gebaseerd apparaat genaamd de XO Pad, ontworpen voor de effectieve verrijking en isolatie van extracellulaire vesiclen. De XO Pad maakt pre-concentratie en isolatie mogelijk zonder het gebruik van chemicaliën of machines, en toont hogere herstelpercentages dan traditionele methoden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biotechnologie
- Extracellulaire vesiclen
Achtergrond
- Extracellulaire vesiclen spelen een cruciale rol in celcommunicatie.
- Conventionele methoden voor het isoleren van deze vesiclen omvatten vaak complexe procedures.
- De XO Pad biedt een eenvoudiger alternatief voor onderzoekers.
- Hogere herstelpercentages kunnen het onderzoek naar extracellulaire vesiclen verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een eenvoudige methode te bieden voor het isoleren van microvesicels en exosomen.
- Om de herstelpercentages te verbeteren in vergelijking met bestaande technieken.
- Om onderzoek naar de biologie van extracellulaire vesiclen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Het ontwerpen van de XO Pad met 12 met was bedekte lagen.
- Het printen van hydrofobe was op cellulosepapier.
- Het verwarmen van het bedrukte papier in een laboratoriumoven.
- Het snijden van het met was bedrukte papier in individuele XO Pad apparaten.
Belangrijkste resultaten
- De XO Pad verrijkt en isoleert effectief extracellulaire vesiclen.
- Demonstreerde hogere herstelpercentages dan conventionele methoden.
- Eenvoudig fabricageproces zonder de noodzaak voor chemicaliën.
- Mogelijkheid voor wijdverbreide toepassing in onderzoek.
Conclusies
- De XO Pad is een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die extracellulaire vesiclen bestuderen.
- Het vereenvoudigt het isolatieproces terwijl de efficiëntie wordt verbeterd.
- Deze methode kan de begrip van extracellulaire vesicle functies bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolation of extracellular vesicles remains a bottleneck in biomarker discovery due to low yield and sample damage from conventional methods. The paper-based Exo-PAD enables chemical-free, fivefold enrichment of microvesicles and exosomes, improving recovery while preserving vesicle integrity. This supports early-stage target validation and assay development by providing a scalable, reproducible workflow for downstream omics and functional analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through enriched vesicle cargo analysis.
- Operational Value: Reduces sample loss and damage compared to ultracentrifugation, increasing usable material for target de-risking.
- Predictive Value: Fivefold enrichment improves signal detection in low-abundance biomarkers, supporting portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, concentrated vesicle preparations suitable for assay standardization.
- Operational Value: Eliminates need for centrifuges or chemicals, simplifying workflow and reducing operational complexity.
- Scalability: Paper-based design allows parallel processing and platform reuse across multiple sample types.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enriched vesicles maintain integrity for downstream functional assays and biomarker profiling.
- Disease-Relevant Systems: Compatible with biofluids like serum or plasma when used with carbonate buffer, supporting clinical relevance.
- Mechanistic De-risking: Reliable isolation enables consistent evaluation of vesicle-mediated mechanisms in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The Exo-PAD fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling reliable vesicle preparation for analytical and functional downstream applications.
- Discovery Biology: Supports functional target validation by providing intact vesicles for cargo analysis and pathway interrogation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs essential for assay readiness and compound screening campaigns.
- Analytics: Enables fluorescence-based quantification and size distribution analysis for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation through preserved vesicle structure and function.
- Enterprise Reuse: Simple fabrication and operation allow adoption as a reusable platform across teams and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through higher recovery and intact vesicle isolation.
- Operational Value: Standardizes enrichment process, reduces reagent waste, and eliminates equipment dependency.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by reducing false negatives in biomarker detection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement through reliable, scalable vesicle preparation for diagnostic and therapeutic applications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in wax patterning and ion concentration polarization principles for device fabrication.
- Needs access to laboratory oven, hot plate, cutter, and voltage source for operation.
- Demands standardization of sample volume, buffer composition, and processing time across users.
- Adaptation to viscous biofluids may require buffer optimization, such as carbonate serum/plasma compatibility.
- Practical limitation: Enrichment is layer-specific (layers 8–9), requiring precise puning for downstream analysis.
