Kwantitatieve real-time PCR-evaluatie van microRNA-expressies in muisnier met eenzijdige ureterale obstructie

Deze methode maakt het mogelijk om microRNA expressie in nieren van muizen te voorzien van een breed scala aan pathologische aandoeningen, zoals nierfibrose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het microRNA expressie profilering met hoge nauwkeurigheid en gevoeligheid mogelijk maakt met behulp van een eenvoudig proces dat tijd bespaart en technische fouten voorkomt. Om de schijnoperatie uit te voeren, gebruik je chirurgische schaar en pincet om een incisie in de huid in de buik te maken en snijd je de spier en het buikvlies membraan van de blaas naar de linker onderrand van de ribben.

Bevochtig twee wattenstaafjes met PBS en trek voorzichtig de darmen naar de zijkant. Plaats de bevochtigde wattenstaafjes om de linkernier en ureter te identificeren. Sluit het buikvlies en vervolgens de incisie met 4-0 nylon.

Om de eenzijdige urethrale obstructie uit te voeren, of UUO, maak een incisie in de huid op de buik en snijd de spier en peritoneale membraan zoals aangetoond voor de schijnoperatie. Plaats een spuit van 2,5 milliliter onder de muis. Bevochtig twee wattenstaafjes met PBS, trek de darmen voorzichtig naar de zijkant met de pincet en plaats de wattenstaafjes om de linker ureter te identificeren.

Gebruik de pincet om de linker nier op te tillen. Gebruik 4-0 zijde om de linker ureter op twee plaatsen ongeveer een centimeter uit elkaar te binden. Snijd de ureter in het midden punt van de twee ligaties en gebruik vervolgens 4-0 nylon hechtingen om het buikvlies en incisie te sluiten.

Na het snijden van het buikvlies, zoals eerder aangetoond, til het op met een pincet en gebruik een chirurgische schaar om een zijwaartse incisie aan de bovenrand te maken en zet u vervolgens de incisie voort langs de laagste rand van de ribben. Identificeer de linkernier en reflux het met PBS totdat de nier geel-wit wordt. Verwijder de nier door het snijden van de linker nierslagader en ader met de chirurgische schaar en plaats het in een petrischaaltje, dan was het zorgvuldig met PBS.

Snijd de nier in ongeveer 10 milligram monsters met de chirurgische schaar en pincet, zet elk stuk van de nier in zijn eigen 1,5-milliliter microcentrifuge buis en sluit de buis dop. Doe een niermonster in de siliconenhomogenisator en voeg 700 microliter van een fenyl/guanidine-gebaseerde lysisreage. Druk langzaam op en draai de stamper van de homogenisator tegen het niermonster om het te homogeniseren.

Herhaal het persen en draaien totdat het monster volledig is opgelost in het lysisreagens. Om het monster verder te homogeniseren, breng je het gehomogeniseerde lysaat over naar de biopolymeerspinkolom en draai je het drie minuten op 14.000 keer G en breng je het neergeslagen lysaat over naar een ongebruikte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Combineer het lysaat in de buis met 140 microliter chloroform en doop de buis stevig vast.

Om het lysaat en chloroform te mengen, moet u de buis 15 keer omkeren. Broed de monsters twee tot drie minuten bij kamertemperatuur en draai ze vervolgens gedurende 15 minuten op 12.000 g bij vier graden Celsius. Zonder het neerslag te verstoren, breng je het supernatant over op een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg je 1,5 keer het volume van 100% ethanol toe.

Vortex het mengsel voor vijf seconden. Laad 700 microliter van het monster op een membraange verankerde spinkolom in een opvangbuis van twee milliliter. Sluit de kolomdop en draai de kolom op 15.000 keer G gedurende 15 seconden en gooi het neergeslagen lysaat in de opvangbuis weg.

Was het monster grondig door 700 microliter wasbuffer één toe te voegen aan de membraanverank in een opvangbuis van twee milliliter. Herhaal vervolgens de centrifugatie en gooi de opvangbuis weg. Herhaal de was twee keer met 500 microliters wasbuffer twee per wasbeurt.

Na de laatste wasbeurt draai je de membraanverank in een verzamelbuis van twee milliliter op 15.000 keer G gedurende een minuut en gooi je het neergeslagen lysaat weg. Breng de membraanverank naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Los het totale RNA op door 30 microliter RNase-vrij water aan de kolom toe te voegen, sluit de kolomdop en laat het vijf minuten op kamertemperatuur.

Draai de kolom vervolgens op 15.000 keer G gedurende een minuut. Breng het monster met totaal RNA over naar een nieuwe microcentrifugebuis op ijs en meet de concentratie van het totale RNA door spectrofotometrie. Bereid een master mix oplossing volgens het manuscript richtingen en voeg acht microliters aan elke buis van een acht-goed buis strip.

Na het aanpassen van de totale RNA-dichtheid, plaats een 12-microliter aliquot van de totale RNA in elke buis en sluit de dop. Centrifuge de buizen gedurende 15 seconden. Leg de buizen in de thermocycler en broed ze 60 minuten uit bij 37 graden Celsius.

Wanneer u klaar bent, onmiddellijk uitbroed ze gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius voor de synthese van cDNA. Breng de cDNA in een nieuwe 1,5-milliliter microcentrifugebuis en verdun het 10 keer met gedestilleerd water. Vortex en centrifugeren de buis gedurende vijf seconden en voeren vervolgens kwantitatieve real-time PCR uit, zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Dit protocol werd gebruikt om een eenzijdige urethrale obstructie muis model te creëren via linker ureterale ligatie in acht weken oude mannelijke muizen met een gewicht van 20 tot 25 gram. Ureters werden volledig belemmerd door dubbele ligatie met 4-0 zijde hechtingen. Nieren werden verzameld op acht dagen na de operatie.

De microRNA qRT-PCR gegevens gaven aan dat het niveau van microRNA 3070-3p aanzienlijk werd verhoogd en de niveaus van microRNA, 7218-5p en microRNA 7219-5p werden verminderd in de nieren van de UUO muizen in vergelijking met de controles. Bij een poging van dit protocol, vergeet niet te herhalen draaien van de nier monster totdat het volledig is opgelost in fenyl / guanidine-gebaseerde lysis reagens om een goede RNA extractie te bereiken.