Diffusional Dynamics of Gold Nanorods visualiseren op celmembraan met behulp van Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Ons protocol maakt gebruik van analyse van één deeltjescontrole om de dynamiek van de locatie en de oriëntatie te controleren en karakteriseert de diffusie van gouden nanorods op celmembranen. Met behulp van deze methode kunnen zowel de translationele als de rotatiedynamiek van gouden nanorods worden verkregen en kan de dynamiek volledig worden geanalyseerd en gepresenteerd. Dit protocol kan worden gebruikt voor de studie van andere soorten complexe biologische systemen.

Begin met het verbranden van een ethanol gedimde glazen coverslip op de vlam en het plaatsen van de coverslip in een celkweekschaal van 35 bij 10 millimeter met twee milliliter celkweekmedium zonder fenolrood. Voeg 50 microliters van de celsuspensie van belang toe aan de coverslip en schud de schaal voorzichtig heen en weer en links en rechts om de cellen gelijkmatig te verdelen. Plaats de schaal ongeveer 12 uur in de celkweekincubator totdat de cellen 20 tot 40% samenvloeiing bereiken voordat u 20 microliters met CTAB-gecoate gouden nanorods aan de schaal toevoegt.

Na zacht schudden om de nanorods gelijkmatig over de schaal te verspreiden, plaatst u de schaal vijf minuten in een bevochtigde atmosfeer. Breng aan het einde van de incubatie langzaam 100 microliters supernatant van de schaal over in de groef van een glazen glijbaan en plaats de coverlipcelzijde voorzichtig naar beneden op de schuifgroef, sluit vervolgens de rand van de afdeklip af met nagellak en laat de nagellak drogen voordat u de dia op de darkfieldmicroscoopfase plaatst. Voor het volgen van enkele deeltjes door middel van darkfield microscopie, plaats een druppel olie op de olie-dompel darkfield condensor en draai aan de knop totdat de condensor contact maakt met de glazen dia.

Plaats een druppel olie op de bovenkant van het afdekglas en draai aan de scherpstelknop totdat de 60X olie-onderdompelingsdoelstelling de olie raakt. Schakel de lichtbron in en draai lichtjes aan de scherpstelknop om het beeldvlak scherp te stellen. Klik vervolgens op het camerapictogram in de microscoopsoftware om een voorbeeld op te nemen dat lichtbeeldtijdreeksen verstrooit met behulp van de CMOS-kleurencamera en sla de afbeelding op in een TIFF-indeling.

Als u één traject voor de lange termijn wilt extraheren, opent u de afbeelding in ImageJ en klikt u op afbeelding, type en 8-bits om de afbeelding van de RGB-modus naar de 8-bits modus te converteren. Als u het contrast wilt aanpassen, klikt u op afbeelding, past u het helderheidscontrast aan, stelt u de parameters in. Selecteer een doeldeeltje en gebruik Control X om de achtergrond van de tijdreeks af te snijden.

Klik op plug-ins, deeltjestracker klassiek en deeltjestracker om het deeltjesdetectie- en deeltjeskoppelingsvenster te openen en stel de straal in op zes, de cutoff op nul en het percentiel op 0,01%Stel het koppelingsbereik in op 10 en de verplaatsing op 10 en klik op OK om het resultatenvenster van de deeltjestracker te openen om de resultaten te zien. Klik op visualiseer alle trajecten om de gegenereerde trajecten te inspecteren. Als het door software gegenereerde traject en het bewegende traject van de gouden nanorods overeenkomen, klikt u op volledig rapport opslaan om de resultaten op te slaan.

Als de door software gegenereerde baan niet overeenkomt met de bewegende baan van de gouden nanorods, klikt u op deeltjes opnieuw koppelen om de gedetecteerde deeltjes opnieuw te koppelen aan verschillende verbindingsbereik- en percentielparameters. Gebruik de xycördinatie om de middelste pixelcoördinaat van de gouden nanostang in elk frame volgens de XY-coördinaat te vinden. m functie.

Als u een matrix van drie bij drie pixels wilt afbakenen, de negen spreidingsintensiteitswaarden van de rode of groene kanalen wilt extraheren en een gemiddelde waarde wilt berekenen, gebruikt u de rgextractie. m functie. Gebruik dan de polarangle.

m functie om de polaire hoeken te berekenen met behulp van de dual channel differentiële methode. Als u dynamische parameters wilt berekenen met behulp van de formules in de tabel, voert u de twee analysescripts uit. Voor visuele analyse van het traject stelt u de X-coördinaat in als X, de Y-coördinaat als Y en de tijd als Y, klikt u vervolgens op plot-, spreidings- en kleurtoewijzing, stelt u de grafiekparameters in en voegt u de kleurbalk toe.

Als u tijdsintervalcijfers voor gemiddelde vierkante verplaatsing wilt genereren, stelt u het tijdsinterval in als X en de gemiddelde vierkante verplaatsing als Y.Click plot, scatter, analysis, fitting, nonlinear curve fitting en open dialogue en stelt u de grafiekparameters in. Voor statistische analyse met meerdere deeltjes stelt u de dynamische parameters van belang in als Y en klikt u op plot en histogram. Dubbelklik op het histogram om de delingsgrootte of het aantal divisies in te stellen en klik op toepassen.

Voeg vervolgens een kolom toe en stel de grafiekparameters in. Stel voor een tijdreeksanalyse de tijd in als X en de tijdreeksparameters als Y.Click plot, multi-pane en stack. Selecteer regel en OK in het pop-upvenster. Stel vervolgens de parameters voor de grafiek in.

Het longitudinale plasmonische maximum van 40 bij 85 nanometer CTAB gecoate gouden nanorods is ongeveer 650 nanometer en de transversale resonantie is 520 nanometer. De strooiintensiteit van de MET CTAB gecoate gouden nanorods op U87-celmembranen toont een typische Gaussiaanse verdeling met een smalle breedte die overeenkomt met die van CTAB-gecoate gouden nanorods op glas, wat aangeeft dat CTAB-gecoate gouden nanorods die in dit experiment worden gevolgd, goed gemonodispergeerd zijn. Zoals geïllustreerd, kunnen meer dan 500 CTAB gecoate gouden nanorod trajecten worden gevolgd door darkfield microscopie en kunnen worden onderverdeeld in diffusietrajecten op lange afstand en beperkte diffusietrajecten.

De straal van gyratie van alle 500 trajecten in deze representatieve analyse toonde een kleine waardeverdeling met een gemiddelde straal van gyratie van 0,5 micrometer en de maximale verplaatsing was meer verdeeld bij kleine waarden. Zoals aangetoond in deze ensembletijdgemiddelde gemiddelde vierkante verplaatsingsanalyse, diffunderen de CTAB gecoate gouden nanorods normaal gesproken met een alfa van ongeveer één. De dichtheidsverdeling van de diffusiecoëfficiënt en de alfa verkregen uit alle trajecten, onthult echter dat de dynamiek van de gouden nanorods een heterogene verdeling vertoont met superdiffusion, Brownian en subdiffusion bewegingen.

Bovendien kunnen statistische analyse van één deeltje en tijdreeksparameteranalyse worden gebruikt om twee representatieve beperkte en bewegende trajecten op lange termijn te karakteriseren. Het is noodzakelijk om een enkele nieuwe interpretatie van gegevens samen te vatten en te extraheren uit de analyse-uitlezing van de analyse van één deeltje, omdat er meestal enkele moeilijke afwegingen moeten worden gemaakt.