Onderzoek naar structurele en dynamische eigenschappen van handel subcellulaire nanostructuren door spatiotemporale fluctuatiespectroscopie

De Imaging the Right Mean Square Displacement Method'is in staat om tegelijkertijd zowel de structuur als de dynamische gemiddelde eigenschappen van een biologisch doelobject in een levend monster te extraheren. Imaging the Right Mean Square Displacement is een snelle en robuuste procedure, zonder dat het nodig is om trajecten van één object te extraheren en zonder complexe etikettering. Het vereist alleen een standaard optische opstelling en een fluorescerend gelabeld object van belang.

De methode effent de weg naar de grootschalige, kwantitatieve screening van de structurele en dynamische veranderingen die worden aangetroffen op het niveau van subcellulaire nanostructuren in verschillende pathologische omstandigheden, zoals kanker, diabetes of neurodegeneratieve aandoeningen. De procedure wordt gedemonstreerd door Fabio Azzarello, een promovendus uit mijn laboratorium. Om te beginnen met het subkweken van de cellen, begint u met het wassen van een met weefselkweek behandelde schaal van 10 centimeter met confluente hela-cellen, tweemaal, met 0,01 molaire PBS.

Voeg vervolgens 1 milliliter van 0,05% trypsine-EDTA toe en incubeer het gerecht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende vijf minuten. Suspensie de losgemaakte cellen opnieuw in 9 milliliter volledig DMEM-medium en verzamel 10 milliliter totaal medium met trypsine in de centrifugebuis. Zaai ongeveer 0,2 miljoen cellen in elke schaal van 35 millimeter bij 10 millimeter met het uiteindelijke mediumvolume van 1 milliliter en incubeer vervolgens de cellen.

Afhankelijk van de subcellulaire structuur van belang, is een specifieke etiketteringsmethode vereist en zodra de etiketteringsoplossing klaar is, wast u de cellen tweemaal met 0,01 molaire PBS. Na het vervangen van PBS door het medium met kleurstof, incubeer je de schotel bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, volgens de aanbeveling van de fabrikant. Aan het einde van de incubatie wast u de cellen twee keer met een vers medium voor het experiment.

Voordat u de time-lapsed serie-acquisitie uitvoert, schakelt u het microscoopincubatorcontrolesysteem in en laat u de microscoop gedurende ongeveer twee uur in evenwicht brengen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Gebruik een argonlaser van 488 nanometer voor excitatie van EGFP in getransfecteerde cellen en macropinesomen met een fluorescentisch label en verzamel de fluorescentie-emissie tussen 500 en 600 nanometer, met behulp van een standaard fotovermenigvuldigingsbuisdetector. Gebruik een helium neonlaser van 543 nanometer om de fluorescerende kleurstof te prikkelen en verzamel de emissie tussen 555 en 655 nanometer.

Stel de diameter van het detectietangje in op de grootte van één Eri. En verzamel voor elke acquisitie een reeks van 1000 opeenvolgende frames. Stel de pixelbezettingstijd in op 2 microseconden per pixel voor een frametijd van 129 milliseconden.

Om de instrumentele parameters voor de acquisities goed te initialiseren, opent u iMSD. M met de software teksteditor. Stel de parameters in door waarden te typen voor N'as het aantal frames in de tijdreeks, pixelgrootte in micrometers en f'as de temporele resolutie in seconden.

Stel verder de invoer van de achtergrondcorrectie van het filter in op nul, om ONBEWERKT-afbeeldingen te verwerken, of één, om een op drempelwaarde gebaseerde achtergrondaftrek uit te voeren. Stel vervolgens de AV-toldrempel in voor achtergrondcorrectie. Als de filterwaarde als één is ingesteld, worden pixels met een intensiteit die lager is dan de drempelwaarde ingesteld op nul.

Stel vervolgens bit in als het gehele getal dat de intensiteitsbemonstering bepaalt. Sla de bewerkte iMSD op en voer deze uit. M-scriptbestand.

Controleer de uitvoering van het script in het opdrachtvenster en als er problemen optreden, wordt het onderbroken waarschuwingsbericht weergegeven. Nadat het script is uitgevoerd, importeert u de afbeeldingsstapel en trekt u indien nodig de achtergrond af. Bereken vervolgens de spacio-temporele correlatiefunctie met behulp van de Fourier-methode.

Pas de spatio-temporele correlatiefunctie aan met een 2D Gaussiaanse functie. Controleer vervolgens de grafische uitvoer met de IMSD-curve en de bijbehorende aanpassingscurven, weergegeven in drie afzonderlijke panelen voor verschillende typen van de gebruikte aanpassingsvergelijking. De R-kwadraatwaarden zijn opgenomen in de grafieklegende.

Controleer vervolgens de tekstuitvoer. De beeldacquisitie van Lysosoom als testorganel werd uitgevoerd in levende cellen met de juiste temporele resolutie en een zeer lage temporele resolutie. De artefactuele vervorming van het Lysosoom als gevolg van organelbeweging, was zichtbaar in het beeld met lage resolutie.

Het intensiteitsprofiel van de spot werd afgeleid met behulp van een lijntool in de beeldanalysesoftware. Vervolgens werd de schatting van de spotdiameter uitgevoerd, door de intensiteit uit te zetten en te interpoleren door een Gaussische functie. De overname met hoge snelheid leverde een vergelijkbare gemiddelde structuurgrootte op die dicht bij de vaste steekproef lag.

In plaats daarvan vergrootte de acquisitie met een lage snelheid de structuurgrootte, vanwege de natuurlijke structuurdynamiek tijdens beeldvorming. De structurele en dynamische eigenschappen van macropinsomen werden waargenomen tijdens de handel. De waarnemingen toonden een afname van de gemiddelde grootte van de macropinosomen.

De gelijktijdige toename van de subdiffusieve beweging werd aangegeven door verlaagde alfawaarden. Voor elke acquisitie werd de toename van het aantal Macropinesomen met de tijd waargenomen. Daarentegen suggereerden vergelijkbare metingen uitgevoerd op ISG's een heel ander gedrag van deze laatste organellen in vergelijking met macropinesomen.

In feite vertonen insulinekorrels onveranderde, gemiddelde structurele of dynamische eigenschappen, wat suggereert dat ze in een stationaire toestand werden onderzocht. De methode kan eenvoudig worden toegepast in de dubbele kleurmodus, als twee verschillende subcellulaire organellen anders worden gelabeld. In dit geval zal kruiscorrelatieanalyse potentiële dynamische interacties van de twee objecten in de cel benadrukken.