Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen
25 oktober 2021
Primaire hepatocyten zijn een waardevol hulpmiddel om leverrespons en metabolisme in vitro te bestuderen. Met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia werd een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen ontwikkeld.
Primaire hepatocyten van muizen zijn belangrijk in leverstudies. Vooral voor glucosemetabolisme en hepatische medicijntests. Qua tijd kan het isolatieproces tijdrovend zijn en de energie kostbaar.
Dit protocol kan een efficiënte manier bieden om primaire hepatocyten van muizen te isoleren. Het is tijd- en arbeidsvriendelijk. Vereist zeer weinig stappen met alle regio's commercieel beschikbaar.
Begin met het gebruik van de peristaltische pomp om opgewarmd dubbel gedestilleerd water op te pompen met een snelheid van 4 ml per minuut, gedurende vijf minuten. Vervang vervolgens de pompbuis van water naar opgewarmd perfusiemedium. Bewaking van de luchtbel tussen het water en het perfusiemedium.
Helpt bij het volgen van de stroom van het perfusiemedium door het systeem. Desinfecteer vervolgens de buik van een verdoofde acht weken oude C57 zwarte 6J vrouwelijke muis met 70% ethanol. En knip met een schaar de buik open om de lever, poortader en inferieure vena cava bloot te leggen.
Stop dan de peristaltische pomp. Na ervoor te hebben gezorgd dat de pompbuis perfusiemedium bevat en geen water. Plaats een 24 gauge katheter in de inferieure vena cava.
Schakel de pomp weer in en snijd de poortader open. Terwijl het perfusiemedium wordt gepompt, drukt u elke minuut op de poortader om de vloeistof elke hoek van de lever te laten bereiken. Blijf ongeveer drie tot vijf minuten pompen of totdat de uitgespoelde vloeistof helder is.
Vervang vervolgens de pompbuis van het perfusiemedium naar het collagenase-dispasemedium. En druk elke minuut op de poortader om de vloeistof elke hoek van de lever te laten bereiken. Ga door met pompen totdat alle 25 ml van het collagenase dispase medium zijn uitgeput.
Isoleer vervolgens de hele lever zonder de galblaas. En plaatste het in 30 ml wasmedium in een petrischaaltje op ijs. Met behulp van een tang scheurt de lever in stukken om primaire hepatocyten in de oplossing vrij te geven.
In dit stadium verandert het wasmedium in een troebele oplossing met vrijgekomen primaire hepatocyten en kleine leverstukjes. Filter deze troebele oplossing door een celzeef van 70 micron, in 20 ml 1X per oproep HBSS in een buis van 50 ml op ijs. En meng de oplossing door de buis 20 keer om te keren.
Centrifugeer vervolgens de oplossing. Adem vervolgens in de weefselkweekkap het supernatant op. En was de pellet met 30 ml koud wasmedium.
Pellet de cellen nogmaals met centrifugeren. Verwijder het supernatant en suspensie de pellet opnieuw in 25 ml kweekmedium. Tel de cellen en plaats ze op gewenste kweekplaten.
Volgens het experimentele ontwerp. Na plating werden geïsoleerde primaire hepatocyten met een uur stevig bevestigd en na 12 uur volledig uitgebreid. In de geïsoleerde hepatocyten waren de mRNA-niveaus van hepatocytmarkers, zoals transthyretine, CD95, ASGR1 en ASGR2 significant verhoogd in vergelijking met de hele lever.
Daarentegen was de aanwezigheid van immuuncellen, stellaatcellen en endotheelcellen lager. Zoals blijkt uit een sterke afname van CD45, collageen type 1 alfa 1 en endotheelcel 2 kinase 2 mRNA niveaus. Wat suggereert dat dit protocol de interferentie van andere levercellen aanzienlijk kan verminderen.
Na plating daalden de ASGR1- en ASGR2-niveaus met de tijd, maar blijven ze vergelijkbaar met de hele lever tot het 12-uurstijdpunt. Speciaal voor ASGR1. Het expressieniveau van membraangebonden CD81 was consistent gedurende maximaal 48 uur.
Ter vergelijking: de tolachtige receptor 4-expressie nam over het algemeen toe en werd hoger dan in vivo niveaus na 48 uur. Insulinegevoeligheidstests toonden aan dat insuline de fosforylering van beide AKT bij serine 473 significant bevorderde. En vorkkopdoos 01 bij serine 256, in de hepatocyten.
Dit geeft de gevoeligheid van primaire hepatocyten voor insuline aan. Fosfoenolpyruvaat carboxykinase eiwit niveaus significant verhoogd na glucagon behandeling. Wat suggereert dat de glucoseproductieroute werd geactiveerd.
Deze activering werd verder bevestigd door een verhoogde glucoseproductie. En met andere glucoseproductiestimulatoren zoals Forskolin + IBMX. Dit protocol kan zowel tijd als energie besparen voor studies met primaire hepatocyten van muizen.
Volgens dit protocol kunnen gerelateerde experimenten zoals het hypothetische glucosemetabolisme en farmaceutische biomarkertests worden uitgevoerd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een arbeids- en tijdefficiënt protocol voor het isoleren van primaire muishepatocyten, die essentieel zijn voor onderzoek naar leverfunctie en metabolisme. De methode maakt gebruik van commercieel beschikbare reagentia om de opbrengst te verhogen en interferentie van niet-parenchymale cellen te minimaliseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Levermetabolisme
- Glucosemetabolisme
- Medicijnonderzoek
Achtergrond
- Primaire hepatocyten van muizen zijn essentieel voor het bestuderen van de leverbiologie.
- Traditionele isolatiemethoden zijn vaak tijdrovend en arbeidsintensief.
- Het verkorten van de isolatietijd kan leiden tot efficiëntere biologische experimenten.
Gebruikte methoden
- Isolatieprotocol met gebruik van een peristaltische pomp en collagenase-dispase medium.
- Muismodel: vrouwelijke C57BL/6J muizen.
- Technieken voor celkweek en het meten van genexpressie.
Belangrijkste resultaten
- Verhoogde mRNA-niveaus van hepatocytmarkers vergeleken met de gehele lever.
- Verminderde aanwezigheid van immuun- en endotheelcellen na isolatie.
- Aangetoonde insulinegevoeligheid en geactiveerde glucoseproductiepaden.
Conclusies
- Dit protocol verbetert de efficiëntie van het isoleren van primaire hepatocyten aanzienlijk.
- Verbeterd inzicht in het glucosemetabolisme en de medicijnrespons bij leverstudies.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Efficiënte isolatie van primaire hepatocyten is cruciaal voor studies naar het levermetabolisme en geneesmiddelentesten, waarbij tijd- en arbeidsbeperkingen de doorvoer in discovery-workflows beïnvloeden. Dit protocol reduceert de isolatietijd tot ~35 minuten terwijl de opbrengst en zuiverheid van de hepatocyten behouden blijven, wat een snelle hypothesetoetsing in preklinische modellen ondersteunt. De methode maakt schaalbare preparatie mogelijk van ziekterelevante systemen voor mechanistische risicoreductie in targetvalidatie- en leadidentificatie-pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Levert gezuiverde hepatocyten voor het onderzoeken van therapeutische hypothesen met betrekking tot het glucosemetabolisme en hepatische responsroutes op geneesmiddelen.
- Operationele waarde: Vermindert de tijd- en arbeidslast, waardoor een hogere doorvoer in assays voor targetvalidatie mogelijk wordt.
- Voorspellende waarde: Levert hepatocyten op met aangetoonde insulinegevoeligheid en activatie van de gluconeogenese, wat bijdraagt aan de mechanistische risicoreductie van levertargets.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert hepatocyten met minimale interferentie van niet-parenchymale cellen, waardoor de assay-specificiteit voor compound-screening wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van commercieel beschikbare reagentia en gestandaardiseerde stappen, wat de reproduceerbaarheid over verschillende screeningcampagnes verhoogt.
- Schaalbaarheid: Maakt de preparatie mogelijk van gevalideerde biologische systemen die geschikt zijn voor high-content- of fenotypische screeningplatforms.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt ziekterelevante systemen voor preklinische validatie van levergerichte verbindingen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Genereert hepatocyten met gevalideerde glucoseproductie en insulinerespons, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen.
- Biomarkerafstemming: Handhaaft de expressie van hepatocytmarkers (ASGR1, ASGR2, CD81) tot 12 uur, wat compatibiliteit met biomarker-assays mogelijk maakt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische studies, en biedt een betrouwbare bron van primaire hepatocyten voor assays van het levermetabolisme.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing van hepatische paden mogelijk door hepatocyten te leveren met bevestigde markerexpressie en functionele responsen.
- Screening: Produceert hepatocyten die geschikt zijn voor de evaluatie van verbindingen dankzij een verminderde contaminatie door stromale cellen en een consistente insulinegevoeligheid.
- Analytics: Ondersteunt kwantitatieve read-outs zoals glucoseproductie, fosforyleringsassays en mRNA-expressie van hepatocytmarkers.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt discovery met preklinisch werk door hepatocyten te leveren die belangrijke metabole functies tot 48 uur behouden.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbare isolatiecapaciteit die de preparatie van hepatocyten over projecten en teams heen standaardiseert.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in studies naar het levermetabolisme door verminderde cellulaire interferentie en functionele validatie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de workflow met minimale stappen en commercieel beschikbare reagentia, wat de efficiëntie in het laboratorium verbetert.
- Strategische waarde: Versnelt tijdlijnen voor ontdekkingen door de isolatietijd te verkorten van uren naar ~35 minuten, waardoor de assayfrequentie toeneemt.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van leverdoelen mogelijk door betrouwbare preklinische modellen te bieden voor mechanismevalidatie.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in muischirurgie en perfusietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot een peristaltische pomp en een steriele weefselkweekomgeving.
- Vereist gestandaardiseerde bereiding van reagentia (perfusiemedium, collagenase dispase, was- en kweekmedia).
- Houdt rekening met aanpassingen voor verschillende muizenstammen of leeftijden buiten het gebruikte C57BL/6J vrouwelijke model.
- Beperkt door de noodzaak voor onmiddellijk gebruik van geïsoleerde hepatocyten om de functionele integriteit te behouden, aangezien de expressie van markers na 12 uur afneemt.
