Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen

Primaire hepatocyten van muizen zijn belangrijk in leverstudies. Vooral voor glucosemetabolisme en hepatische medicijntests. Qua tijd kan het isolatieproces tijdrovend zijn en de energie kostbaar.

Dit protocol kan een efficiënte manier bieden om primaire hepatocyten van muizen te isoleren. Het is tijd- en arbeidsvriendelijk. Vereist zeer weinig stappen met alle regio's commercieel beschikbaar.

Begin met het gebruik van de peristaltische pomp om opgewarmd dubbel gedestilleerd water op te pompen met een snelheid van 4 ml per minuut, gedurende vijf minuten. Vervang vervolgens de pompbuis van water naar opgewarmd perfusiemedium. Bewaking van de luchtbel tussen het water en het perfusiemedium.

Helpt bij het volgen van de stroom van het perfusiemedium door het systeem. Desinfecteer vervolgens de buik van een verdoofde acht weken oude C57 zwarte 6J vrouwelijke muis met 70% ethanol. En knip met een schaar de buik open om de lever, poortader en inferieure vena cava bloot te leggen.

Stop dan de peristaltische pomp. Na ervoor te hebben gezorgd dat de pompbuis perfusiemedium bevat en geen water. Plaats een 24 gauge katheter in de inferieure vena cava.

Schakel de pomp weer in en snijd de poortader open. Terwijl het perfusiemedium wordt gepompt, drukt u elke minuut op de poortader om de vloeistof elke hoek van de lever te laten bereiken. Blijf ongeveer drie tot vijf minuten pompen of totdat de uitgespoelde vloeistof helder is.

Vervang vervolgens de pompbuis van het perfusiemedium naar het collagenase-dispasemedium. En druk elke minuut op de poortader om de vloeistof elke hoek van de lever te laten bereiken. Ga door met pompen totdat alle 25 ml van het collagenase dispase medium zijn uitgeput.

Isoleer vervolgens de hele lever zonder de galblaas. En plaatste het in 30 ml wasmedium in een petrischaaltje op ijs. Met behulp van een tang scheurt de lever in stukken om primaire hepatocyten in de oplossing vrij te geven.

In dit stadium verandert het wasmedium in een troebele oplossing met vrijgekomen primaire hepatocyten en kleine leverstukjes. Filter deze troebele oplossing door een celzeef van 70 micron, in 20 ml 1X per oproep HBSS in een buis van 50 ml op ijs. En meng de oplossing door de buis 20 keer om te keren.

Centrifugeer vervolgens de oplossing. Adem vervolgens in de weefselkweekkap het supernatant op. En was de pellet met 30 ml koud wasmedium.

Pellet de cellen nogmaals met centrifugeren. Verwijder het supernatant en suspensie de pellet opnieuw in 25 ml kweekmedium. Tel de cellen en plaats ze op gewenste kweekplaten.

Volgens het experimentele ontwerp. Na plating werden geïsoleerde primaire hepatocyten met een uur stevig bevestigd en na 12 uur volledig uitgebreid. In de geïsoleerde hepatocyten waren de mRNA-niveaus van hepatocytmarkers, zoals transthyretine, CD95, ASGR1 en ASGR2 significant verhoogd in vergelijking met de hele lever.

Daarentegen was de aanwezigheid van immuuncellen, stellaatcellen en endotheelcellen lager. Zoals blijkt uit een sterke afname van CD45, collageen type 1 alfa 1 en endotheelcel 2 kinase 2 mRNA niveaus. Wat suggereert dat dit protocol de interferentie van andere levercellen aanzienlijk kan verminderen.

Na plating daalden de ASGR1- en ASGR2-niveaus met de tijd, maar blijven ze vergelijkbaar met de hele lever tot het 12-uurstijdpunt. Speciaal voor ASGR1. Het expressieniveau van membraangebonden CD81 was consistent gedurende maximaal 48 uur.

Ter vergelijking: de tolachtige receptor 4-expressie nam over het algemeen toe en werd hoger dan in vivo niveaus na 48 uur. Insulinegevoeligheidstests toonden aan dat insuline de fosforylering van beide AKT bij serine 473 significant bevorderde. En vorkkopdoos 01 bij serine 256, in de hepatocyten.

Dit geeft de gevoeligheid van primaire hepatocyten voor insuline aan. Fosfoenolpyruvaat carboxykinase eiwit niveaus significant verhoogd na glucagon behandeling. Wat suggereert dat de glucoseproductieroute werd geactiveerd.

Deze activering werd verder bevestigd door een verhoogde glucoseproductie. En met andere glucoseproductiestimulatoren zoals Forskolin + IBMX. Dit protocol kan zowel tijd als energie besparen voor studies met primaire hepatocyten van muizen.

Volgens dit protocol kunnen gerelateerde experimenten zoals het hypothetische glucosemetabolisme en farmaceutische biomarkertests worden uitgevoerd.