Name: Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Leer een tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor de isolatie van primaire muizenhepatocyten met behulp van een peristaltische pomp en collageenase-dispase medium. Deze methode verbetert de opbrengst en vermindert verontreiniging door niet-parenchymale cellen voor leveronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 aan S.W.).

Alle procedures werden goedgekeurd door de Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. C57BL/6 vrouwelijke muizen (8 weken oud) werden gebruikt in deze studie.
1. Voorbereiding:
<ol><li>Meng William's E Medium (GlutaMAX Supplement) met 10% FBS en 1% antibiotisch-antimycotische oplossing om het kweekmedium te maken.</li>
	<li>Filter 25 ml collagenase-dispase medium (bijv. Liver Digest Medium) door een spuitfilter van 0,45 μm om deeltjesresten te verwijderen.</li>
	<li>Verwarm 50 ml dubbel gedestilleerd H2O (ddH2O), 35 ml perfusiemedium (bijv. leverperfusiemedium) (of 50 ml bij de eerste keer met behulp van dit protocol) en 25 ml gefilterd collagenase-dispase medium in een waterbad van 45 °C gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Meng in een steriele weefselkweekkap 2 ml 10x HBSS en 18 ml Percoll in een buis van 50 ml om 20 ml 1x percoll-HBSS te maken en houd op ijs of 4 °C. LET OP: 1x Percoll-HBSS kan minstens 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Giet in een steriele weefselkweekkap 30 ml wasmedium (bijv. Hepatocyte Wash Medium) in een schone petrischaal en bewaar op ijs.</li>
	<li>Dompel de pompbuis onder in het water van een waterbad van 45 °C. De resultaten zijn het meest betrouwbaar als de kamertemperatuur 25 °C is.</li>
	<li>Bereid 2 ml 1x anesthetica door 225 μL Ketamine HCL, 93,75 μL Xylazine en 1681 μL 1x PBS te mengen.</li>
	<li>Verdoven één muis met behulp van een goedgekeurde methode. Hier werd de muis intraperitoneaal geïnjecteerd met 150 μL 1x anesthetica. Voer de tests uit voor verlies van reflexen zoals reactie op teen knijpen om volledige anesthesie te garanderen.</li>
	<li>Bevestig de muis op zijn rug op het dissectiepad met vier ledematen, door vast te pinnen of waterbestendige tape of andere methoden te gebruiken die zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee (of equivalenten) van de instelling.</li>
	<li>Bereid gesteriliseerde tang en schaar voor op dissectie. Om mogelijke besmetting te voorkomen, voert u alle stappen uit in een steriele kap.</li>
</ol>2. Werkwijze:
<ol><li>Gebruik een peristaltische pomp en begin opgewarmd ddH2O te pompen met een snelheid van 4 ml / min gedurende 5 minuten. Verander de pompbuis van water in een opgewarmd perfusiemedium.</li>
	<li>Desinfecteer de buik van de verdoofde muis met 70% EtOH en knip open met een schaar om de lever, poortader en inferieure vena cava (IVC) bloot te leggen.</li>
	<li>Stop de peristaltische pomp. Plaats een katheter van 24 G (bijv. gesloten IV-katheter, 24 G, 0,75 INCH) in IVC. Begin met pompen en snijd de poortader open.</li>
	<li>Blijf pompen totdat de uitgespoelde vloeistof helder is (ongeveer 3-5 min). Druk elke minuut op de poortader om vloeistof elke hoek van de lever te laten bereiken. Pas op dat u geen luchtbellen in het IVC laat komen. OPMERKING: Deze stap is om zoveel mogelijk bloed uit de lever te spoelen.</li>
	<li>Verander de pompbuis van het perfusiemedium naar het collagenase-dispase medium. Blijf pompen totdat alle 25 ml van het collagenase-dispase medium is uitgeput tijdens het uitvoeren van stap 2.6.</li>
	<li>Druk elke minuut op de poortader om vloeistof elke hoek van de lever te laten bereiken. OPMERKING: In dit stadium is het volledige bloedverlies fataal voor de muis. De dood van de muis kan worden bevestigd door een gebrek aan hartslag na het experiment. Gooi het karkas weg volgens het facilitaire beleid.</li>
	<li>Isoleer de hele lever zonder galblaas tot het wasmedium van 30 ml in de petrischaal op ijs.</li>
	<li>Scheur het in stukken met een tang om primaire hepatocyten in oplossing vrij te geven. Deze stap zou het wasmedium veranderen in een troebele oplossing vol vrijgegeven primaire hepatocyten en kleine leverstukjes.</li>
	<li>Filtreer de troebele oplossing in stap 2.8 door een celzeef van 70 μm in de 20 ml 1x Percoll-HBSS in een buis van 50 ml op ijs. Meng door de buis 20 keer om te keren.</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>In de weefselkweekkap, zuig het supernatant op. Was de pellet met koud 30 ml wasmedium.</li>
	<li>Centrifugeer bij 50 x g gedurende 5 min bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 25 ml van het kweekmedium (of geschikte andere volumes) in de weefselkweekkap.</li>
	<li>Tel het celnummer en plaats de cellen op gewenste kweekplaten volgens het experimentele ontwerp. OPMERKING: Primaire hepatocyten die goed geïsoleerd zijn van één 8 weken oude muis zijn meestal voldoende om te worden verguld op vier 6-well platen of vier 12-well platen.</li>
</ol>

<ol><li>Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+metabolism+from+a+liver-centric+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).</li>
<li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes%3A+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cell+polyploidization%3A+a+pivotal+role+for+binuclear+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li>
<li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> Elife. 4, 11214(2015).</li>
<li>Bruening, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+enters+liver+cells+using+the+CD81+receptor+complex+proteins+calpain-5+and+CBLB%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).</li>
<li>Silvie, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+CD81+is+required+for+Plasmodium+falciparum+and+Plasmodium+yoelii+sporozoite+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity.</a> Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).</li>
<li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+as+immunological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes as immunological agents.</a> Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).</li>
<li>Liu, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TR4+orphan+nuclear+receptor+reduces+phosphoenolpyruvate+carboxykinase-mediated+gluconeogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis.</a> Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotrope+androgen+receptor+mediates+pituitary+responsiveness+to+hormones+and+androgen-induced+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility.</a> JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).</li>
<li>Santos, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+transthyretin+neuroprotection+in+a+mouse+model+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).</li>
<li>Pinhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Fas+and+FasL+is+associated+with+infectious+complications+and+severity+of+experimental+severe+acute+pancreatitis+by+promoting+apoptosis+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes.</a> Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).</li>
<li>Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mannose+and+asialoglycoprotein+receptor+expression+determines+glycoprotein+hormone+half-life+at+critical+points+in+the+reproductive+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).</li>
<li>Tanowitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+mediates+productive+uptake+of+N-acetylgalactosamine-conjugated+and+unconjugated+phosphorothioate+antisense+oligonucleotides+into+liver+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).</li>
<li>Manczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralization+of+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+decreases+amyloid+beta+1-42+and+suppresses+microglial+activity+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK1-dependent+transphosphorylation+of+JAK2+limits+the+antifibrotic+effects+of+selective+JAK2+inhibitors+on+long-term+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).</li>
<li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+angiogenesis+markers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of angiogenesis markers.</a> American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-147%2C+a+microRNA+that+is+induced+upon+Toll-like+receptor+stimulation%2C+regulates+murine+macrophage+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+expressing+minimally+humanized+CD81+and+occludin+genes+support+Hepatitis+C+virus+uptake+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo.</a> Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).</li>
<li>Renshaw, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+impaired+Toll-like+receptor+expression+and+function+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging.</a> Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+l-azidohomoalanine+labeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+Journal%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar Journal. 6, 169(2007).</li>
<li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation%3A+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).</li>
<li>Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf</a> (2021).</li>
<li>Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cancer+cell+of+origin%2C+molecular+class%2C+and+effects+on+patient+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis.</a> Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).</li>
<li>Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+location+and+distribution+of+hepatic+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Differential location and distribution of hepatic immune cells.</a> Cells. 6 (4), 48(2017).</li>
<li>Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes%3A+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).</li>
<li>Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History%2C+heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).</li>
<li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells%3A+Physiology+and+role+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li>
<li>Peter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD95+receptor%3A+apoptosis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CD95 receptor: apoptosis revisited.</a> Cell. 129 (3), 447-450 (2007).</li>
<li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).</li>
<li>Willoughby, J. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+GalNAc-siRNA+conjugate+activity+in+pre-clinical+animal+models+with+reduced+asialoglycoprotein+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression.</a> Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).</li>
<li>Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer+cells+protect+liver+sinusoidal+endothelial+cells+from+Fas-dependent+apoptosis+in+sepsis+by+down-regulating+gp130%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn verschillende primaire hepatocytenisolatieprotocollen ontwikkeld. Ze zijn ook geoptimaliseerd en aangepast op basis van verschillende behoeften (tabel 1). Isolatieprotocollen bestaan over het algemeen uit twee delen: perfusie (inclusief enzymvertering) en zuivering.
De perfusie kan worden uitgevoerd met de gehele lever in vivo 2,20,21,22,23 of met ontlede leverkwabben </sup...

De lever dient als een van de belangrijkste organen in het gewervelde lichaam vanwege de vitale rol die het speelt in tal van levensondersteunende functies zoals voedselvertering, bloedcirculatie en ontgifting. Het gebruik van primaire hepatocyten in vitro kweek van muizen wordt steeds populairder in studies naar koolhydraatmetabolisme en levercarcinoom. Daarom is het belangrijk om een handige methode te ontwikkelen voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen met behoud van de aangeboren fysiologische functie. Vanwege zijn functie als een hub van glucosemetabolisme, staat de lever ook centraal in de glucoseproductie en -opslag1. Experimenten met primaire hepatocyten in vitro zijn een must voor de meeste glucosemetabolismestudies. Daarom hebben verschillende onderzoeksgroepen jarenlang protocollen ontwikkeld voor primaire hepatocytenisolatie van muizen.
De algemene procedure van muishepatocytenisolatie is om eerst bloed in de lever weg te spoelen met een isosmotische vloeistof zoals fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) en vervolgens collagenase-bevattende oplossing te gebruiken om hepatocyten te dissociëren. Deze protocollen delen een algemene procedure, maar verschillen in reagentia en stappen op basis van verschillende behoeften. Het voorbereiden van vereiste reagentia en het uitvoeren van isolatiestappen kost echter tijd. Bij de ontwikkeling van het huidige protocol is efficiëntie voorop gesteld, waarbij alle reagentia gebruiksklaar en uit de markt leverbaar zijn, en zo min mogelijk stappen. Het algemene doel van dit protocol is om een snelle en arbeidsefficiënte methode te bieden om primaire hepatocyten van muizen te isoleren, zonder de geïsoleerde primaire hepatocytenzuiverheid en levensvatbaarheid in gevaar te brengen.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>12-well Plate</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td>Coating niet vereist</td></tr><tr><td>6-well Plate</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td>Coating niet vereist</td></tr><tr><td>anti-AKT</td><td>Cell Signaling</td><td>2920S</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>anti-FOXO1</td><td>Cell Signaling</td><td>97635S</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>Cell Signaling</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>anti-p-AKT (S473)</td><td>Cell Signaling</td><td>9271L</td><td></td></tr><tr><td>anti-PEPCK</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-166778</td><td></td></tr><tr><td>anti-p-FOXO1 (S256)</td><td>Cell Signaling</td><td>84192S</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer, 70 &micro;m</td><td>CELLTREAT</td><td>229483</td><td></td></tr><tr><td>Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN</td><td>Becton Dickinson</td><td>383511</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1443001</td><td></td></tr><tr><td>EnzyChrom Glucose Assay Kit</td><td>BioAssay Systems</td><td>EBGL-100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3917-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2044</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody</td><td>LI-COR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Wash Medium</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Cell Signaling</td><td>13630S</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Lilly</td><td>NDC 0002-8215-01</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCL (100 mg/mL)</td><td>Hospira Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td>Alikoteer in weefselkweekkap tot 25 mL elk in 50 mL buis, en bewaar in -20 &deg;C vriezer</td></tr><tr><td>Liver Perfusion Medium</td><td>Gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 2</td><td>In staat om te pompen op 4 mL/min</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td>In staat om 50 mL buis te centrifugeren bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Sodium L-Lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter, PVDF 0.45 &micro;m 30mm diameter</td><td>CELLTREAT</td><td>229745</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 0.5 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 60 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tube, 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Tube, 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath Tank</td><td>Corning</td><td>CLS6783</td><td>Of een waterbadtank die in staat is om op te warmen tot 45 &deg;C</td></tr><tr><td>William&rsquo;s E Medium (GlutaMAX Supplement)</td><td>Gibco</td><td>32551020</td><td></td></tr><tr><td>Xylozine (100 mg/mL)</td><td>Vetone Anased LA</td><td>NDC13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primaire hepatocyten worden op grote schaal gebruikt in lever in vitro onderzoek, vooral in glucosemetabolisme studies. Een basistechniek is aangepast op basis van verschillende behoeften, zoals tijd, arbeid, kosten en primair hepatocytengebruik, wat resulteert in verschillende primaire hepatocytenisolatieprotocollen. De vele stappen en tijdrovende reagenspreparaten in primaire hepatocytenisolatie zijn echter grote nadelen voor de efficiëntie. Na het vergelijken van verschillende protocollen voor hun voor- en nadelen, werden de voordelen van elk gecombineerd en werd een snel en efficiënt primair hepatocytenisolatieprotocol geformuleerd. Binnen slechts ~ 35 minuten zou dit protocol evenveel, zo niet meer, gezonde primaire hepatocyten kunnen opleveren als andere protocollen. Verder valideerden glucosemetabolisme-experimenten uitgevoerd met behulp van de geïsoleerde primaire hepatocyten het nut van dit protocol in in vitro levermetabolismestudies. We hebben ook uitgebreid de betekenis en het doel van elke stap in deze studie beoordeeld en geanalyseerd, zodat toekomstige onderzoekers dit protocol verder kunnen optimaliseren op basis van behoeften.

Om de efficiëntie te testen, werd het huidige primaire hepatocytenisolatieprotocol uitgevoerd op 8 weken oude vrouwelijke C57BL / 6-muizen. De hechting en zuiverheid van geïsoleerde primaire hepatocyten werden getest. Primaire hepatocytenisolatie wordt gebruikt voor een breed scala aan experimenten op leverfysiologie, zoals levergeneesmiddeleffecten en glucosemetabolisme, farmaceutische biomarkeractiviteit2, insulinegevoeligheid en glucoseproductie. Daarom werden de activiteiten van de primaire he...

Primaire hepatocyten zijn een waardevol hulpmiddel om leverrespons en metabolisme in vitro te bestuderen. Met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia werd een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen ontwikkeld.

Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Primaire hepatocyten van muizen zijn belangrijk in leverstudies. Vooral voor glucosemetabolisme en hepatische medicijntests. Qua tijd kan het isolatieproces tijdrovend zijn en de energie kostbaar.Dit protocol kan een efficiënte manier bieden om primaire hepatocyten van muizen te isoleren. Het is tijd- en arbeidsvriendelijk. Vereist zeer weinig stappen met alle regio's commercieel beschikbaar.Begin met het gebruik van de peristaltische pomp om opgewarmd dubbel gedestilleerd water op te pompen met een snelheid van 4 ml per minuut, gedurende vijf minuten. Vervang vervolgens de pompbuis van water naar opgewarmd perfusiemedium. Bewaking van de luchtbel tussen het water en het perfusiemedium.Helpt bij het volgen van de stroom van het perfusiemedium door het systeem. Desinfecteer vervolgens de buik van een verdoofde acht weken oude C57 zwarte 6J vrouwelijke muis met 70% ethanol. En knip met een schaar de buik open om de lever, poortader en inferieure vena cava bloot te leggen.Stop dan de peristaltische pomp. Na ervoor te hebben gezorgd dat de pompbuis perfusiemedium bevat en geen water. Plaats een 24 gauge katheter in de inferieure vena cava.Schakel de pomp weer in en snijd de poortader open. Terwijl het perfusiemedium wordt gepompt, drukt u elke minuut op de poortader om de vloeistof elke hoek van de lever te laten bereiken. Blijf ongeveer drie tot vijf minuten pompen of totdat de uitgespoelde vloeistof helder is.Vervang vervolgens de pompbuis van het perfusiemedium naar het collagenase-dispasemedium. En druk elke minuut op de poortader om de vloeistof elke hoek van de lever te laten bereiken. Ga door met pompen totdat alle 25 ml van het collagenase dispase medium zijn uitgeput.Isoleer vervolgens de hele lever zonder de galblaas. En plaatste het in 30 ml wasmedium in een petrischaaltje op ijs. Met behulp van een tang scheurt de lever in stukken om primaire hepatocyten in de oplossing vrij te geven.In dit stadium verandert het wasmedium in een troebele oplossing met vrijgekomen primaire hepatocyten en kleine leverstukjes. Filter deze troebele oplossing door een celzeef van 70 micron, in 20 ml 1X per oproep HBSS in een buis van 50 ml op ijs. En meng de oplossing door de buis 20 keer om te keren.Centrifugeer vervolgens de oplossing. Adem vervolgens in de weefselkweekkap het supernatant op. En was de pellet met 30 ml koud wasmedium.Pellet de cellen nogmaals met centrifugeren. Verwijder het supernatant en suspensie de pellet opnieuw in 25 ml kweekmedium. Tel de cellen en plaats ze op gewenste kweekplaten.Volgens het experimentele ontwerp. Na plating werden geïsoleerde primaire hepatocyten met een uur stevig bevestigd en na 12 uur volledig uitgebreid. In de geïsoleerde hepatocyten waren de mRNA-niveaus van hepatocytmarkers, zoals transthyretine, CD95, ASGR1 en ASGR2 significant verhoogd in vergelijking met de hele lever.Daarentegen was de aanwezigheid van immuuncellen, stellaatcellen en endotheelcellen lager. Zoals blijkt uit een sterke afname van CD45, collageen type 1 alfa 1 en endotheelcel 2 kinase 2 mRNA niveaus. Wat suggereert dat dit protocol de interferentie van andere levercellen aanzienlijk kan verminderen.Na plating daalden de ASGR1- en ASGR2-niveaus met de tijd, maar blijven ze vergelijkbaar met de hele lever tot het 12-uurstijdpunt. Speciaal voor ASGR1. Het expressieniveau van membraangebonden CD81 was consistent gedurende maximaal 48 uur.Ter vergelijking: de tolachtige receptor 4-expressie nam over het algemeen toe en werd hoger dan in vivo niveaus na 48 uur. Insulinegevoeligheidstests toonden aan dat insuline de fosforylering van beide AKT bij serine 473 significant bevorderde. En vorkkopdoos 01 bij serine 256, in de hepatocyten.Dit geeft de gevoeligheid van primaire hepatocyten voor insuline aan. Fosfoenolpyruvaat carboxykinase eiwit niveaus significant verhoogd na glucagon behandeling. Wat suggereert dat de glucoseproductieroute werd geactiveerd.Deze activering werd verder bevestigd door een verhoogde glucoseproductie. En met andere glucoseproductiestimulatoren zoals Forskolin + IBMX. Dit protocol kan zowel tijd als energie besparen voor studies met primaire hepatocyten van muizen.Volgens dit protocol kunnen gerelateerde experimenten zoals het hypothetische glucosemetabolisme en farmaceutische biomarkertests worden uitgevoerd.

an-improved-time-labor-efficient-protocol-for-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier tonen wij een enzymatische benadering van primaire hepatocyten te isoleren van volwassen muizen, en beschrijven we de kwantificering van een ontstekingsreactie middels ELISA en real-time PCR.

Inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van Muizen

Het doel van dit protocol is te verkrijgen van hoge levensvatbaarheid en hoog rendement van hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen van lever. Dit wordt bereikt door zoogdierlevercellen de lever met een type IV collagenase oplossing via de portal ader, gevolgd door differentiële centrifugeren hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen te verkrijgen.

Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van gezonde en functionele primaire muisknop hepatocyten. Instructies voor het opsporen van hepatische ontluikende eiwitsynthese door niet-radioactieve labeling substraat werden verstrekt om te helpen begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de eiwitsynthese in het kader van de homeostase van de energie-metabolisme in de lever.

Isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve L-azidohomoalanine Labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese

Hier gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van muizen hepatocyten van volwassen muis levers met behulp van een gemodificeerde Collagenase perfusie techniek. Ook beschreven is de lange termijn cultuur van hepatocyten in een 3D collageen sandwich setting evenals immunolabeling van de cytoskelet componenten om gal canaliculaire vorming en de respons op de behandeling te bestuderen.

Isolatie en 3D collageen sandwich cultuur van primaire muis hepatocyten te bestuderen van de rol van Cytoskeleton in Gal Canalicular vorming in vitro

Dit protocol beschrijft het gebruik van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslangen, temperatuurregeling aangevuld met real-time monitoring en een alarmsysteem voor tweestaps collagenaseperfusieprocedure om de consistentie in de levensvatbaarheid, opbrengst en functionaliteit van geïsoleerde primaire rathepatocyten te verbeteren.

Isolatie van primaire rattenhepatocyten met multiparameterperfusiecontrole

Vetzuur β-oxidatie is een essentiële metabole route die verantwoordelijk is voor het genereren van energie in veel verschillende celtypen, waaronder hepatocyten. Hier beschrijven we een methode om vetzuur β-oxidatie te meten in vers geïsoleerde primaire hepatocyten met behulp van 14C-gelabeld palmitinezuur.

Meting van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde muizenhepatocyten

Hier schetsen en demonstreren we een protocol voor primaire muis lever sinusoïdale endotheelcel (LSEC) isolatie. Het protocol is gebaseerd op levercollageaseperfusie, niet-parenchymale celzuivering door centrifugeren met lage snelheid en CD146 magnetische kraalselectie. We fenotyperen en karakteriseren deze geïsoleerde LSEC's ook met behulp van flowcytometrie en scanning elektronenmicroscopie.

Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen

Dit protocol beschrijft technieken voor het isoleren van primaire muizenhepatocyten uit de lever en het elektropoderen van CRISPR-Cas9 als ribonucleoproteïnen en mRNA om een therapeutisch doelgen geassocieerd met een erfelijke stofwisselingsziekte van de lever te verstoren. De beschreven methoden resulteren in een hoge levensvatbaarheid en hoge niveaus van genmodificatie na elektroporatie.

Elektroporatie-gemedieerde toediening van Cas9 ribonucleoproteïnen en mRNA in vers geïsoleerde primaire muizenhepatocyten

Met lipiden beladen hepatocyten zijn inherent aan leverregeneratie, maar gaan meestal verloren bij centrifugatie van dichtheidsgradiënt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd celisolatieprotocol dat steatotische hepatocyten behoudt, wat representatieve populaties van regenererende hepatocyten oplevert na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.

Isolatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde tweestaps collagenase-leverperfusietechniek in een rattenmodel en toont het gebruik van geïsoleerde hepatocyten voor in vitro langdurige kweek van 3D-organoïden.

Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur

Leer een tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor de isolatie van primaire muizenhepatocyten met behulp van een peristaltische pomp en collageenase-dispase medium. Deze methode verbetert de opbrengst en vermindert verontreiniging door niet-parenchymale cellen voor leveronderzoek.

Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen

Meer video's verkennen