Isolatie van primaire rattenhepatocyten met multiparameterperfusiecontrole

Dit isolatieprotocol voor rattenhepatocyten is gebaseerd op de leverresectie voorafgaand aan de verteringsbenadering. Het protocol introduceert een compact en draagbaar geïntegreerd perfusiesysteem voor celisolatie. Deze techniek omvat collagenase-recirculatie die het volume van collagenasegebruik vermindert en meer flexibiliteit biedt bij het verlengen van de verteringstijd, terwijl een hoge zwaartekrachtopbrengst en hepatocytenspecifieke functie worden gegarandeerd.

Zet de rat in de motorkap. Na het doorsnijden van de buikspieren, duwt u de darmen naar rechts met de achterkant van de gebogen tang. Breek het membraan onder het galkanaal met de punt van de gebogen tang voor het lusen van de hechtdraad rond de poortader en het galkanaal.

Gebruik een zijden chirurgische hechting om een zeer losse ligatuur te maken rond de poortader dicht bij de lever, net voordat de ader zich links en rechts in verschillende leverkwabben vertakt. Ongeveer twee tot drie centimeter stroomopwaarts van de eerste ligatuur, net voordat de maagader zich van de poortader vertakt, creëert u een gat door het weefsel onder de poortader met de uiteinden van twee paar gebogen tangen. Rek vervolgens het gat uit om de poortader te ondersteunen tijdens de cannulatie.

Voorkom drukopbouw in de lever door de pompsnelheid te verlagen tot vier rpm voor een debiet van ongeveer drie milliliter per minuut. En zorg ervoor dat de uitstroom van de calciumvrije buffer uit de intraveneuze katheter wordt gereduceerd tot een langzaam infuus. Terwijl u de poortader voorzichtig ondersteunt met een tang, houdt u de intraveneuze katheter vast met de schuine kant van de naald naar boven gericht.

En steek de naald in de poortader in een hoek van 10 tot 20 graden. Ga dan langzaam verder totdat de hele schuine kant zich in de ader bevindt. Correct inbrengen moet resulteren in blancheren van de leverkleur.

Beweeg de canule over de naald en trek de naald achter de canule terug door de vleugel met de wijsvinger terug te trekken terwijl je de katheter met de duim en middelvinger vasthoudt. Bevestig de poortader op de katheter met een aderclip en clip onder de poortader om verstoring van de doordruppeling van de doordrenking te voorkomen. Snijd vervolgens de infrahepatische inferieure vena cava om de drukopbouw in de lever te voorkomen en let op bloedspurtende impulsen om de juiste snede te garanderen.

Verhoog de pompsnelheid tot 38 RPM voor een debiet van ongeveer 33 milliliter per minuut. En spoel de lever drie keer door de infrahepatische inferieure vena cava twee tot drie seconden met een tang te sluiten en vervolgens opnieuw te openen. Om alle leverlobben te perfuseren, past u de positie van de canuletip aan en zorgt u ervoor dat deze wordt geplaatst voordat de poortader zich in verschillende leverlobben vertakt.

Span vervolgens de losse ligatuur rond de poortader aan, iets stroomopwaarts van het vertakkingspunt, en zet de positie van de canule in de poortader vast om terugstroming van de buffer te voorkomen door drie knopen te maken op het punt waar de harde naald de canule ondersteunt, tussen de schuine kant en het zijgat. Laat de lever na leverresectie gedurende 12 minuten doordringen met de calciumvrije buffer. Draai vervolgens de rolklem van de calciumvrije buffer aan en maak de rolklem van collagenasebuffer los om de perfusiebuffer te veranderen.

Nadat de collagenasebuffer de lever heeft bereikt, spoelt u de lever drie keer door de suprahepatische inferieure vena cava gedurende twee tot drie seconden te sluiten en opnieuw te openen. Verplaats de lever voorzichtig naar het stadium bovenop het bekerglas voor recirculatie van de collagenasebuffer door het diafragma met een tang vast te houden terwijl u de katheter ondersteunt, en zorg ervoor dat u niet aan de katheter trekt om onbedoelde loslating te voorkomen. Verteer de lever gedurende 12 minuten en stop de perfusie wanneer de lever zijn gladde bruine textuur verliest en papperig wordt.

Verleng indien nodig de verteringstijd. Na de vertering van de lever snijdt u de poortader voorzichtig de canule. En breng vervolgens de lever over in koude DMEM om de hepatocyten te isoleren.

Tik zachtjes op de lever met behulp van de achterkant van de gebogen tang om de glinsterende capsule te breken en af te pellen. En laat de levercellen vrij door de lever zachtjes in DMEM te zwaaien totdat de cellen volledig zijn gedissocieerd in de media. De levensvatbaarheid van hepatocyten lag tussen 88 en 94,8% zoals bepaald door trip en blauwe telling.

De opbrengst van hepatocyten van ratten met een gewicht van 200 tot 300 gram was tot vijf keer 10 tot de achtste cellen per isolatie. De representatieve beelden tonen ongezuiverde levercelsuspensie en gezuiverde hepatocytensuspensie. De zuiverheid van de geïsoleerde hepatocyten was ongeveer 96,8%, wat werd gekwantificeerd door albuminepositieve fluorescerende gekleurde cellen te tellen in relatie tot het totale aantal celkernen.

In de representatieve afbeeldingen die in valse kleuren worden weergegeven, vertegenwoordigt groen het albumine en blauw de celkernen met albumine. Celkernen zonder albumine zijn rood gemarkeerd. De hepatocyten in sandwichcultuur vormden verschillende galkanaaliculi en hadden goed celcelcontact.

Zoals aangetoond door albumine-, ureum- en cytochroom P450-testen, vertoonden de hepatocyten een hoge ureum- en albuminesecretie. Op dag drie vertoonden de hepatocyten hoge enzymactiviteiten voor CYP1A2, CYP2B1/2 en CYP3B2. Wees mentaal voorbereid voordat u de naald in de poortader steekt.

Bij het inbrengen moet een chirurg doorgaan zonder polsslag totdat de pompsnelheid is verhoogd na het snijden van de IVC.