Isolatie en time-lapse beeldvorming van primaire muisembryo's van palatale mesenchymcellen om collectieve bewegingskenmerken te analyseren

Dit protocol stelt onderzoekers in het craniofaciale veld in staat om collectief bewegingsattributen in controle- en mutante cellen kwantitatief te vergelijken als een middel om mesenchymale remodellering te begrijpen tijdens palatale plankverhoging. Het gebruik van primaire muisembryonale palatale mesenchymale cellen en time-lapse beeldvorming bieden een toegankelijke proxymethode voor het beoordelen van palatale schapverhogingsdynamiek. Om palatale schelpen van een muizenembryo te oogsten, gebruikt u een gesteriliseerde geperforeerde lepel om een embryonale dag 13,5 embryo in een steriele schaal van 10 centimeter gevuld met steriel MEPM-kweekmedium onder een stereomicroscoop te plaatsen.

Steek na onthoofding een punt van een gesteriliseerde fijne No.5-tang in de mond net binnen de wang en duw de punt van de tang totdat deze de achterkant van de schedel verlaat. Oriënteer de tang zo dat de andere arm net over de gehoorgang zweeft voordat je de tang dichtknijpt om het weefsel door te snijden. Herhaal de incisie aan de andere kant van het hoofd en zet de knijpprocedure voort totdat de onderkaak, tong en het inferieure deel van de schedel zijn verwijderd, waardoor de palatale planken worden blootgesteld.

Met het hoofd op zijn kant geplaatst, plaats je de uiteinden van een kleine, steriele, roestvrijstalen schaar voor en achter de schedel, ongeveer op ooghoogte van het embryo en snijd je net boven de ogen om de schedel van de schedel te verwijderen, waardoor een plat oppervlak ontstaat. Plaats vervolgens het hoofd ondersteboven met het superieure aspect plat op de bodem van de schaal en zoek de palatale planken, die zichtbaar moeten zijn als twee verhoogde bruggen aan weerszijden van de centrale groef in de voorste helft van het hoofd. Om het hoofd aan de schaal te beveiligen, steekt u een punt van een fijne tang door het weefsel in de buurt van het neusgebied van het hoofd vooraan naar de palatale planken en de andere door de basis van de schedel achteraan naar de palatale planken.

Steek beide punten van een tweede paar zeer scherpe, fijne tangen in het weefsel aan de basis van het laterale oppervlak van de plank en knijp langzaam en voorzichtig om het weefsel te snijden. Herhaal de incisie langs de basis van het mediale oppervlak van de plank en aan zowel de voorste als de achterste uiteinden van de plank om de plank los te maken van de bevestiging aan het hoofd, til vervolgens voorzichtig de plank op en maak extra knijpen indien nodig om de schaal volledig te bevrijden van het omliggende weefsel. Wanneer de tweede palatale plank op dezelfde manier is verwijderd, gebruikt u een steriele plastic boltransferpipet om de planken over te brengen in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter in ongeveer 500 microliter PBS op ijs.

Om een MEPM-celkweek op te zetten, wanneer alle planken zijn verzameld, aspirateer je de PBS zonder de weefsels te verstoren en voeg je onmiddellijk 200 microliter van 37 graden Celsius 0,25% trypsine toe aan elke buis van palataal plankweefsel. Gebruik een pipet van 1.000 microliter om de weefsels een paar keer kort te pipetteren en incubeer de weefsels gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius, waarbij u na vijf minuten kort pipettert. Pipetteer de weefsels aan het einde van de incubatie opnieuw voordat u 800 microliter MEPM-kweekmedium aan elke buis toevoegt en de buizen centrifugeert om de cellen te verzamelen.

Na het opzuigen van het supernatant, resuspendeert u de pellets in één milliliter vers MEPM-kweekmedium per buis en vergulden u de cellen in individuele putten van een met zes putweefselkweek behandelde plaat met twee milliliter per put tot een eindtotaal van drie milliliter per put, en laat de cellen zich vervolgens gedurende 12 uur hechten aan het plastic oppervlak in een steriele celkweekincubator. Om een collectieve 2D-migratietest op te zetten, verwijdert u de bovenkant van een steriele siliconeninzetstuk met twee putten tot een hoogte van ongeveer een millimeter voor elk te analyseren monster en gebruikt u steriele tangen om de verkorte, steriele twee-putinzetstukken in het midden van individuele putten van een zes-putplaat te plaatsen. Druk langs alle randen naar beneden om ervoor te zorgen dat de inzetstukken volledig op de putbodems zijn geplakt en zaai 300 MEPM-cellen per vierkante millimeter van de verkorte siliconeninzetstukken in een totaal volume van 40 tot 50 microliter MEPM-kweekmedium in elke insert voor een nachtelijke incubatie in de celkweekincubator.

Om een wondreparatietest op te zetten, gebruikt u een steriele tang om één ongewijzigde steriele siliconeninzet met twee putten in het midden van één put van een plaat met zes putten per monster te plaatsen en drukt u stevig op de randen van het inzetstuk om het inzetstuk aan de kweekplaat te bevestigen. Zaai vervolgens 1.400 cellen per vierkante millimeter in 100 microliter MEPM-kweekmedium in elke insert en incubeer de cellen gedurende 48 uur in het celkweekmedium. Bij het uitvoeren van een collectieve 2D-migratietest biedt het zaaien van de cellen in siliconeninzetstukken met twee putten in een grote kweekschaal meestal een betere celdichtheid voor beeldvorming.

Kleine 3D-geprinte ringen geplaatst in een 35 millimeter schotel kunnen ook worden gebruikt voor 2D-motiliteitsanalyse. Voor wondhersteltests worden de cellen gekweekt in siliconeninzetstukken met twee putten tot een hoge samenvloeiing. De inserts worden vervolgens verwijderd en de wond wordt in beeld brengen tot sluiting.

MEPM-trajecten zijn persistent en de richting van de celmotiliteit wordt gedurende enkele uren gehandhaafd. De gemiddelde verplaatsing versus tijd analyse geeft aan dat de persistentie in de vorm van verplaatsing evenredig is met de verstreken tijd. Stroomanalyse van de motiliteitsgegevens laat zien dat de co-bewegende MEPM-celclusters ongeveer 300 micron groot zijn.

Er wordt ook een diepgaand motiliteitsverschil waargenomen tussen wildtype en gemuteerde MEPM-cellen. Deze procedure kan worden gebruikt op verschillende transgene muislijnen en om MEPM-cellen te behandelen met verschillende biochemische reagentia om hun effecten op celbewegingen te bestuderen. We hebben ons gericht op primaire palatale mesenchymcellen, maar de time-lapse beeldvorming en kwantitatieve analyses kunnen ook worden gebruikt om de migratiekenmerken van elk beweeglijk celtype in dynamische ontwikkelingsprocessen te onderzoeken.