Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in

Het algemene doel van het gebruik van software voor beeldanalyse en ontwikkelingsbiologie is het verkrijgen van kwantitatieve gegevens voor mechanistische modellen van biologische processen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals hoe mutante fenotypes kwantitatief kunnen worden geanalyseerd. Het belangrijkste voordeel van deze methodologie is dat het onderzoekers in staat stelt om veranderingen in biologische processen en ontwikkelingsverschijnselen op een onbevooroordeelde manier te identificeren.

Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de ontwikkeling en morfogenese van sea elegance, kan deze ook worden toegepast op andere modelorganismen zoals josepha. De reconstructie van de celvorm met IOD zal worden gedemonstreerd door CINA Leman, een promovendus in mijn laboratorium. Open na het installeren van het IM MOD-programma de eunuch shell en typ Im mod in het IM mod-venster. Selecteer het bestand met de juiste ruwe gegevens waaruit een 3D-model moet worden gegenereerd en gebruik het informatievenster om de onder- en bovenkant van de objecten in het zap-venster te lokaliseren.

Trek in het informatievenster opnieuw de celomtrekken na door de eerste contour op het bovenste vlak van elke cel te maken, waarbij u erop let dat u voor elke cel een nieuw object aanmaakt. Scroll vervolgens naar beneden in Z en maak voor elk Z-vlak een nieuwe contour aan, en daarna een nieuw object voor elke cel. Nadat u zoveel cellen heeft omlijnd als geschikt is voor het model, opent u het venster voor modelweergave om de objecten en hun contouren te inspecteren.

Kies vervolgens in de werkbalk van de modelweergave voor bewerken en objecten. Het betreffende bewerkingsvenster wordt geopend om alle cellen als gevulde en gesloten objecten te modelleren. Kies mesh als het type tekengegevens en vullen als de tekenstijl.

Klik op meshing en vink de optie cap aan. Selecteer vervolgens zoveel objecten als nodig en klik op mesh. Het programma zal vervolgens solide objecten genereren uit de stapels contouren.

Pas de Z-schaal in het weergavevenster aan om de Z-bemonsteringsfactor naar behoefte bij te stellen. Selecteer vervolgens onder het bewerkingsmenu de weergave om de 3D-objecten te roteren, en sla indien nodig momentopnamen of films van de cellen op om objecten uit fluorescentie time-lapse opnames te volgen. Gebruik eerst NDR om de ruwe gegevens om te zetten in een TIFF-bestand.

Open vervolgens het bestand. In end drop selecteert u het icoon voor de 2D-viewer en klikt u onder het datamenu op het icoon voor het aanpassen van het bereik (fit range) om het histogram aan te passen.

Selecteer het bestand, de naam, de afbeelding, de set en het kanaal, en stel de X, Y, Z-resolutie in door de X-, Y- en Z-waarden in te voeren. Om de kernen te annoteren, gaat u naar het vlak van interesse en selecteert u opnieuw de 2D-viewer. Selecteer vervolgens lineage uit het vervolgkeuzemenu en kies voor new lineage.

Klik en sleep over de kern van belang om deze te markeren. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de kern en kies 'rename particle'. Voer in het vervolgkeuzemenu een naam voor het deeltje in en sleep daarna het pijlpictogram om de diameter van de cirkel te wijzigen.

Klik vervolgens op het rechtericoon om het centrale vlak van de nucleus te markeren. Om daarna verder te gaan in tijd en vlak, kiest u de opties voor frame en Z in de onderste werkbalk en past u de positie of grootte van de cirkel die de nucleus markeert dienovereenkomstig aan totdat de gevolgde cel zich deelt. Wanneer een celdeling wordt waargenomen, markeert u de dochternuclei en klikt u op het venstericoon om over te schakelen naar de lineage.

De kijker markeert alle drie de kernen gelijktijdig en selecteert 'associate parent' onder de optie 'lineage'. Wanneer alle cellen zijn gevolgd, klikt u op de bestandsnaam en schakelt u over naar het kanaal. Markeer het restant van de celdeling om de corticale stroom kwantitatief te analyseren met behulp van particle image velocity symmetry-software.

Laad de nieuwe afbeeldingsbestanden in pif lab en selecteer de sequentiestijl. 1, 2, 2, 3. Navigeer vervolgens naar de directory met de sequentie van de gewenste afbeeldingen.

Selecteer de afbeeldingen en klik op toevoegen om de afbeeldingen te importeren. Selecteer vervolgens onder analyse-instellingen de uitsluitingen. ROI-masker en gebruik de knop.

Teken maskers voor het huidige frame om het ongewenste deel van de beelden uit te schakelen onder de analyse-instellingen. Selecteer opnieuw de PIF-instellingen en kies voor fast Fourier transformation window deformation als het gewenste PIF-algoritme. Voer voor de eerste passage een waarde voor het interrogatiegebied in van 64 pixels met een stap van 32 voor de tweede passage.

Voer een waarde van 32 pixels in voor het interrogatiegebied met een stap van 16. Selecteer vervolgens lineair in het vervolgkeuzemenu voor vensterdeformatie en kies de Gaussian two by three point methode voor subpixel-verplaatsingsschatting. Selecteer nu analyze in het analysemenu en kies analyze all frames post-processing, selecteer vector validation in het post-processing menu en pas een standaarddeviatiefilterdrempel van zeven toe op alle frames via het plotmenu.

Selecteer afgeleide parameters. Wijzig de gegevens, gevolgd door de vectoren en pixels per frame, en pas de gladheid van de vectoren en het high-passfilter aan. Nadat deze aanpassingen op alle frames zijn toegepast, stelt u de gebruikte frames in van één tot het einde.

Klik ten slotte op de knop 'calculate mean vectors' om de gemiddelde vectoren van alle frames te meten, met de focus op de draaiing van de gonade van wild-type C. elegans volwassenen die zojuist zijn afgebeeld. Op basis van de microscopiedata wordt een 3D-model van de kiemcellen gegenereerd, waardoor analyse mogelijk is van de veranderingen in celgrootte die optreden terwijl de cellen via tweekleurige time-lapse microscopie van de distale naar de proximale arm van de cus migreren. De modellen verkregen door histonfusie-eiwitten en niet-spier myosine in NDR illustreren het stereotiepe patroon van celdeling en overerving van remnanten.

Bovendien kunnen uit de lijndata de trajecten voor elke cel L en elk residu van de celdeling, en de correlatie met de timing van de celdeling, in dit experiment worden verkregen. Kortstondige time-lapse microscopie met een hoge temporele resolutie van corticaal niet-spier myosine twee werd uitgevoerd om, zoals verwacht, verschillen in de dynamiek van de corticale polariserende stroom tussen wildtype embryo's en embryo's waarin het row gtpa-activerende eiwit RGA drie was uitgeput, te evalueren. De stroom in de wildtype embryo's verliep voornamelijk langs de lange as van het embryo.

Terwijl de stroom in het RGA drie RNA-interferentie-embryo orthogonaal aan deze as was, wat duidelijk bleek uit de PIP-analyse. Zodra men de techniek beheerst, kan de handmatige segmentatie van complexe objecten en celtracking tijdens de embryonale ontwikkeling in enkele uren worden voltooid indien correct uitgevoerd, terwijl men probeert de cel- en objecttracking uit te voeren. Het is belangrijk om een passende temporele resolutie in te stellen, zodat het object tijdens de analyse met de hier beschreven drie tools niet verloren gaat.

Statistische analyse kan ook worden uitgevoerd om vragen over variabiliteit te beantwoorden of om verschillende embryo's met elkaar te vergelijken. De implementatie van software voor kwantitatieve beeldanalyse stelt ons en andere ontwikkelingsbiologen in staat om morfogenetische ontwikkelingsmechanismen te onderzoeken met een ongekend detailniveau. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het gebruik van een diverse set softwaretools voor het uitvoeren van kwantitatieve beeldanalyse.