Name: Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in C. elegans Het gebruik van open-source tools (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Leer hoe u ontwikkelingsprocessen in C. elegans kunt volgen en kwantificeren met open-source tools zoals IMOD en NDR. Deze methode maakt 3D-celreconstructie en onbevooroordeelde fenotype-analyse mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben niets te onthullen.

1. Bereiding van C. elegans embryo&#39;s voor Time-lapse Microscopie met Microbeads <ol><li> Transfer gravid volwassen wormen met behulp van een worm pick (platina draad) in een daling van de M9 buffer en schoon uit bacteriën door eerst krachtig roeren en vervolgens de overdracht van elke worm aan een aangrenzende druppel M9 met behulp van een wimpers gemonteerd op een tandenstoker / pipetpunt of gebruik een puntig glas capillair. </li><li> Verdun de dispersie bevattende 20 urn diameter polystyreen kralen 10-voudig in M9-buffer (1 L M9 buffer bevat 3 g KH 2PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, en na autoclaafbehandeling (20 min, 120 ° C), voeg nog eens 1 ml van een 1 M MgSO4 oplossing). </li><li> Wordt mondpipet ieder type dunne glazen capillair (bijvoorbeeld smeltpunt capillairen of capillairen gebruikt voor injectienaalden trekken), een ongeveer 0,5 m lang stuk rubber, siliconen of soortgelijk materiaal buis (idealiter transparant), een 200 glpipetpunt, het deksel van een 200 pi PCR-buis, een hydrofoob filter voor kleine spuiten (bv., een 0,2-0,45 urn poriegrootte en 15-50 mm diameter nylon, PTFE of gelijkaardig materiaal filter) en een 1000 pi pipetpunt . Deze vorm van de mond pipet zorgt ervoor dat geen biologisch materiaal in contact kunnen komen met de experimentator. </li><li> Monteer de pipet aan door de 200 ul pipetpunt met de punt naar voren in de buis en sluit met het deksel van een PCR-buis met een centrale perforatie die overeenkomt met de diameter van het capillair gebruikte heeft. Een wees priem of preparaat naald kan worden gebruikt om de perforatie te genereren. </li><li> Teken een dunne capillaire en plaats deze in de perforatie. Plaats de filter in het andere uiteinde van de slang en plaats een 1000 pi pipetpunt als mondstuk (figuur 1). </li><li> Ontleden zwangere volwassenen door te snijden wormen dwars op de vulva met een schone scheermesje of scalpel. OPMERKING: Meestal zal veel embryo&#39;s zijn expulsed na het snijden. Echter, als vroege embryo&#39;s nodig zijn, ze soms moeten worden vrijgesteld van het karkas met behulp van een wimpers of puntige naald. </li><li> Pipet een druppel van de verdunde polystyreenparel dispersie (~ 4 pl) op een 24x60 mm dekglas en overdracht van embryo&#39;s in deze daling via de mond pipet. </li><li> Plaats voorzichtig een kleine (bijvoorbeeld 18x18 of 20x20 mm) te dekken glas op de top van de drop en zorg ervoor dat de daling volledig verspreid. OPMERKING: De daling moet ook voldoende klein zijn niet om de randen van de kleine dekglas raken. </li><li> Verzegeling van de berg met vloeibare vaseline. Voeg een druppel immersie olie op de 24x60 mm dekglas kant en ga verder met de sectie &#39;Time-lapse Microscopie&#39;. </li></ol> 2. Voorbereiding van Adult C. elegans Dieren voor Time-lapse Microscopie met Nanobeads LET OP: In het algemeen is het protocol voor het monteren van volwassen dieren is een aanpassing van het protocol van de ref. 18.Met dit protocol is het mogelijk om lange termijn time-lapse confocale microscopie van volwassen dieren voeren. <ol><li> Bereid een 1,5% (w / v) agarose oplossing in M9 buffer, kook (1 min, 100 ° C in een waterbad of microgolf). Het gebruik van hogere concentraties agarose wordt niet aanbevolen, aangezien dit kan leiden tot extrusie van de darm en / of delen van de gonaden. </li><li> Stok neer 2-3 lagen van de band op twee microscoopglaasjes elk. Plaats een dia zonder band tussen de twee dia&#39;s met tape. </li><li> Gebruik een pipet en plaats een druppel hete agarose oplossing in het midden van de middelste schuif. Plaats snel andere dia naar de druppel zodat het wordt ondersteund door de tape lagen aan elke kant. Dit zal een ronde en platte agar pad van ongeveer 10 mm diameter maken. </li><li> Een druppel 100 nm bead oplossing (onverdunde, die 2,6% (w / v)) op het kussen. Transfer 10/01 schoongemaakt volwassen wormen in de drop met een worm pick. Seal met 18x18 mm dekglas en vaseline zoals uitgelegd in Protocol 1. </li></ol> 3. Time-lapse microscopie <ol><li> Doe een druppel immersie olie op de microscoop dia of het deksel glas sandwich. Gebruik brightfield bij een lage vergroting (5x of 10x lenzen) om het monster te lokaliseren. OPMERKING: Beperk de blootstelling aan blauw licht zoveel mogelijk (in het bijzonder voor C. elegans embryo&#39;s), bijvoorbeeld, maken geen gebruik van epi-fluorescentie microscopie te vinden / concentreren van het model, maar in plaats daarvan gebruiken helderveld. </li><li> Wissel naar hogere vergroting (40x of 60x doelstellingen), breng het monster in beeld (hetzij middenvlak of boven / onder vlakken van het monster, afhankelijk van de acquisitie software). </li><li> Stel de sampling intervallen tot 30 vliegtuigen op 1 micrometer tussenruimte opgenomen elke 1min. Indien een automatische xy of xyz-stadium beschikbaar is, kunnen meerdere plekken worden opgenomen in een sessie. Schakelen naar fluorescentie beeldvorming en controleer de scherpstelling nogmaals. OPMERKING: Probeer te voorkomen dat het gebruik van hoge laser bevoegdheden, gebruik liever iets langere belichtingstijdenbij zeer lage intensiteit. Maatregel verkregen beelden meteen, hetzij in het beeld acquisitie programma of in ImageJ tot verzadiging, welke gewassen de dynamiek variëren vermijden en betekent ook dat overmatige blootstelling aan straling. </li><li> Start de opname van de time-lapse-serie. OPMERKING: Om het analyseren van artefacten uit te sluiten, te beginnen met een lange (3-10 min) tijdsintervallen tussen sample scannen en geleidelijk te verhogen temporele bemonstering op de gewenste tijdstippen. Ontwikkelingstiming en eindpunten in beide gevallen gelijk te zijn bij het uitvoeren van een statistische analyse. Bovendien is het vaak noodzakelijk om fototoxiciteit overlevingskansen beoordelen. Daarom herstellen exemplaar uit de berg na langdurige time-lapse microscopie en controleren of ze blijven om live te ontwikkelen /. </li></ol> 4. Het reconstrueren van een 3D-Cell Shape model met IMOD OPMERKING: IMOD software is beschikbaar op de IMOD webpagina: http://bio3d.colorado.edu/imod/. De installatie van de software is te beschrijvend daar. Bij het gebruik van Windows-besturingssysteem, een Unix-toolkit moet worden geïnstalleerd, die ook kan worden gevonden als een pakket op de IMOD webpagina. Bovendien is er een uitstekend samengesteld 3dmod introductie op de IMOD webpagina (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html). <ol><li> Open de Unix shell en type in &quot;IMOD&quot;. Het venster IMOD wordt geopend. Selecteer het bestand met de ruwe gegevens (idealiter een gestapelde tif of dergelijke) om een ​​3D-model te genereren. </li><li> Zoek de onderkant en bovenkant van de objecten in het venster zap met behulp van de informatie venster (up &amp; down scrolling tool). </li><li> Start het opsporen van de cel contouren. Belangrijker is, ervoor te zorgen dat elke cel is een object. Begin met het bovenvlak van elke cel en maak de eerste contouren zijn er met behulp van de informatie-venster. Scroll naar beneden in z en maak een nieuwe contour voor elk z-vlak. </li><li> Doe hetzelfde voor zoveel cellen als nodig te modelleren in 3D. Vergeet niet om een ​​nieuw object te maken bij het starten met een nieuwe cel. NOTE: Er zijn veel verschillende manieren voor contour tracing en diverse behulpzaam plugins. Bezoek de IMOD webpagina en online tutorials voor details. In de hier getoonde geval is de standaardinstelling gebruikt. </li><li> Open het venster &quot;Model View&quot; om de objecten en hun contouren te inspecteren. </li><li> In de &quot;Model View&quot; werkbalk kies &quot;Edit&quot; - &quot;objecten&quot;. De respectieve bewerken venster wordt geopend. </li><li> Modelleren cellen als gevuld en gesloten objecten, kies &quot;Netwerk&quot; als &quot;Trek Data Type&quot; en &quot;Fill&quot; als &quot;Stijl van de Tekening&quot;. Klik op &quot;Meshing&quot; in de scrollable selectie in de linker benedenhoek van het venster. Controleer de optie &quot;Cap&quot; in de selectie bij de lagere rechter. Controleer zoveel objecten als nodig is en klik op &quot;All Mesh&quot;. Het programma vaste voorwerpen uit de stapels contouren genereren. De z-bemonstering factor kan worden ingesteld door het veranderen van &quot;Z-schaal&quot; in het venster &quot;View&quot;. </li><li> Move / draaien van de 3D bezwaart (&quot;Edit&quot; - &quot;View&quot;) en op te slaan foto&#39;s of films (&quot;File&quot; - &quot;Snap Tiff als ...&quot; of &quot;Movie / Montage&quot;). </li></ol> 5. Tracking fluorescent gelabelde Structuren met Endrov OPMERKING: Om de celdeling resten volgen, gebruik dan een stam met een nucleaire of plasmamembraan marker voor de cel identificatie (bv H2B, PH-PLC-D1) en een celdeling overblijfsel marker (bijv NMy-2, ZEN-4 ). De nucleaire of plasmamembraan marker is belangrijk om te bepalen welke cel de celdeling overblijfsel erft. <ol><li> Voor het snel laden en het gebruiksgemak, de ruwe gegevens moeten worden omgezet in een tiff-bestand (bijvoorbeeld in ImageJ). Vervolgens openen Endrov en laad het bestand te analyseren door te kiezen voor de &quot;Load file&quot; optie in het menu bestand. Klik op het icoon &quot;2D-viewer&quot; op de werkbalk. </li><li> Pas het histogram door te klikken op het pictogram &quot;Fit range&quot; (de blauwe icoon in de rechter benedenhoekvan het scherm Endrov). Stel de XYZ-resolutie door te gaan naar &quot;Data&quot; - &quot;bestandsnaam&quot; - &quot;afbeeldingset&quot; - &quot;Kanaal&quot; - &quot;Set XYZ-resolutie&quot;. Typ waarden van X, Y en Z, bijvoorbeeld, 5, 5, 1 indien X en Y resolutie is 0,2 urn en 1 urn monsters elk in Z. </li><li> Voor annoteren de kernen, te verplaatsen naar het vlak van de rente en klik op &quot;2D-viewer&quot;. Selecteer &quot;Lineage&quot; uit het dropdown menu en kies &quot;Nieuwe lijn&quot;. </li><li> Door te klikken en te slepen op de kern, kan het worden gemarkeerd. Naar de kern te noemen, klik met de rechtermuisknop en kies &quot;Rename deeltje&quot; uit het dropdown menu. Te verhogen of de diameter van de cirkel te verlagen, sleept u de pijl die aan de linkerzijde van de gemarkeerde cirkel verschijnt. Aan het centrale vlak van de kern te markeren, klikt u op het juiste pictogram. Bij gebruik van een plasmamembraan marker kan een grote bol getrokken dat de meeste cellen zullen dekken. </li><li> Om verder te gaan in de tijd en het vliegtuig, kies dan de &quot;Frame&quot; en &quot;Z&quot;opties op de onderste werkbalk. Na het gaan naar de volgende keer punt, pas de positie of de grootte van de cirkel die de kern vormt dienovereenkomstig. Herhaal dit tot de gevolgde cel deelt. </li><li> Wanneer er sprake is van een celdeling, markeren de dochter kernen en over te schakelen naar &quot;Lineage kijker&quot;. Dit kan worden geselecteerd door te klikken op het pictogram &quot;Windows&quot; op de bovenste werkbalk. Markeer alle drie kernen tegelijk, gaat u naar de optie &quot;Lineage&quot; in de werkbalk en kies &quot;Associate ouder&quot;. </li><li> Wanneer cell tracking klaar is, over te schakelen naar het kanaal te markeren van de celdeling overblijfsel voor tracking. Om kanalen te schakelen, klikt u op de naam van het bestand op de linker benedenhoek van de werkbalk. De celdeling restant (of andere structuren) kunnen worden gevolgd zoals hierboven beschreven voor de kern. </li><li> Bij terugkeer naar de software na sluiting, is het nodig om naar &quot;2D Viewer&quot; - &quot;Lineage&quot; - &quot;Edit&quot; en op het geslacht nummer dat wordt bewerkt. </li&gt; </ol> 6. Het analyseren Cortical actomyosine Flow met PIVlab OPMERKING: PIVlab is een vrij beschikbare software van: http://pivlab.blogspot.de/; kan vanuit het Matlab command line omgeving worden ingeroepen door het intikken PIVlab_GUI. Bij het werken met PIVlab, is het raadzaam om het beeld-serie in een aparte map op te slaan. <ol><li> Start een nieuwe sessie van het menu &quot;Bestand&quot;. Laad de beeldbestanden door te klikken op de &quot;Afbeeldingen laden&quot; knop. </li><li> Selecteer de sequencing stijl 1-2, 2-3, ... en navigeer naar de map met de volgorde van de gewenste beelden bevat. Selecteer de beelden en klik op de knop &#39;Toevoegen&#39; en import. </li><li> Ga naar &#39;Analyses instellingen &quot;en selecteer&quot; uitsluitingen (ROI, Mask) &quot;. U kunt ook op &#39;Ctrl + E &quot;. Met de toets &quot;Draw masker (en) voor huidige frame&quot; aan het ongewenste gedeelte van het beeld / s (dat wil zeggen, gebied buiten embryo) inactiveren. </li><li> Selecteer &quot;PIV instellingen&quot; frOM het menu &quot;Analyses instellingen&quot;. U kunt ook op &quot;Ctrl + S&quot;. Kies &quot;FFT venster vervorming&quot; als de gewenste PIV-algoritme. OPMERKING: Fast Fourier transformatie (FFT) reduceert de rekentijd slechts wordt aanbevolen het signaal goed boven lawaai en indien de verplaatsing van de bestudeerde deeltjes niet groter is dan de helft van het gebied pas geanalyseerd (zie 6.5). </li><li> Voer de volgende waarden voor de drie passen, die het gebied van verhoor voor intensiteit kruis correlatie tussen opeenvolgende beelden zijn: Pass 1: Ondervraging oppervlakte van 64 pixels met een stap van 32 Pass 2: Ondervraging van 32 pixels met een stap van 16 . Selecteer &quot;lineair&quot; uit het venster vervorming drop-down menu. Kies Gauss 2 * 3-punts methode voor sub-pixel verplaatsing schatting. </li><li> Selecteer &quot;Analyseren!&quot; Analyse van het menu en gebruik de knop &quot;Analyseren alle frames&quot; een analyse te beginnen. </li><li> Voor nabewerking selecteren &quot;Vector validatie&quot; uit &quot;; Bericht verwerking menu &quot;en zet de standaarddeviatie (Stdev) filter drempel tot 7 en gelden voor alle frames. </li><li> Kies &quot;Leid parameters / gegevens te wijzigen&quot; uit het menu &quot;Plot&quot;. Selecteer &quot;Vectors [px / Frame]&quot; van dropdown menu. Pas de gladheid van vectoren en high-pass filter en gelden voor alle frames. </li><li> Om gemiddelde vectoren van alle frames te berekenen, zet de &quot;Gebruikte frames&quot; tot 1: einde en klik op &quot;Bereken gemiddelde vectoren&quot; knop. </li></ol>

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+cell+lineages+originate+in+the+gastrula+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish.</a> Science. 231 (4736), 365-368 (1986).</li>
<li>Nishida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+in+ascidian+embryos+by+intracellular+injection+of+a+tracer+enzyme.+III.+Up+to+the+tissue+restricted+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage.</a> Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+plant+growth+in+4D%3A+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).</li>
<li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li>
<li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146 (4), 568-581 (2011).</li>
<li>Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+inference+of+systems-level+mechanistic+models+of+development+from+live-imaging-based+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis.</a> Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).</li>
<li>Amat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+accurate+reconstruction+of+cell+lineages+from+large-scale+fluorescence+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data.</a> Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).</li>
<li>He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).</li>
<li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+rotational+cortical+flow%2C+asymmetric+midbody+positioning%2C+and+spindle+rotation+mediates+dorsoventral+axis+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans.</a> Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).</li>
<li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+function+for+the+midbody+remnant+in+embryonic+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A function for the midbody remnant in embryonic patterning.</a> Commun. Integr. Biol. 7, e28533(2014).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endrov%3A+an+integrated+platform+for+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Endrov: an integrated platform for image analysis.</a> Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).</li>
<li>Thielicke, W., Stamhuis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIVlab+-+Towards+User-friendly%2C+Affordable+and+Accurate+Digital+Particle+Image+Velocimetry+in+MATLAB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Open+Research+Software%22%5BJournal%5D)">PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB.</a> Journal of Open Research Software. 2 (1), e30(2014).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), e53419(2013).</li>
<li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li>
<li>Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+GTPase-activating+proteins+RGA-3+and+RGA-4+are+required+to+set+the+initial+size+of+PAR+domains+in+Caenorhabditis+elegans+one-cell+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).</li>
<li>Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+novel+RhoGAP+proteins+RGA-3+and+RGA-4+in+the+germ+line+and+in+the+early+embryo+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans.</a> Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).</li>
<li>Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+torque+generation+by+the+actomyosin+cell+cortex+drives+left-right+symmetry+breaking%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking.</a> Elife. 3, e04165(2014).</li>
<li>Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+specification+of+the+embryonic+lineage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).</li>
<li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cell+sorting+in+the+C.+elegans+embryo+defines+a+new+mechanism+for+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation.</a> Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).</li>
<li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li>
<li>Giurumescu, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).</li>
<li>Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan+defines+precise+spindle+orientation+by+modulating+Wnt+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans.</a> Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).</li>
<li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope%3A+variability+of+development+and+regional+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).</li>
</ol>

Onderzoek in het lab van CP wordt gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; FOR 1756) en het LOEWE Onderzoekscluster Ubiquitin Networks. CP wordt verder ondersteund door het Europees programma kaderprogramma 7 (Marie Curie Actions Project 326632).

Door middel van het volgen object in ontwikkeling, met name de nucleaire tracking, is het mogelijk geweest om de centrale patroonvorming mechanismen van C. helderen elegans embryogenese 1,23,24. Uitbreiding van deze strategie tot een hogere doorvoersnelheid, is onlangs onmogelijk geweest om extra patronen regels te ontdekken en voor te stellen een methode hoe patronen afleiden regels de novo 10. Voor veel mutanten, maar de precieze patroon defecten nog onbekend. De hier b...

Met de gestage verbetering van de fluorescerende eiwitten, genoom engineering, lichtmicroscopie en computer soft- en hardware, is het nu mogelijk om de ontwikkeling van vele modelorganismen opnemen met ongekende ruimtelijke en temporele resolutie. Dit stelt onderzoekers in staat om vragen die niet eerder konden worden aangepakt vragen of bekende ontwikkelingsprocessen opnieuw in om te zoeken naar het hoofd gezien aspecten. Deze vooruitgang is op het gebied van kwantitatieve ontwikkelingsbiologie, die gericht is op het transformeren van kwalitatieve, informele modellen in kwantitatieve modellen door een grondige metingen en statistische analyses aangewakkerd. Tracking cellen en subcellulaire structuren heeft het mogelijk gemaakt om kwantitatieve modellen van embryonale ontwikkeling, zenuwstelselactiviteit of celdeling 1-12 afleiden. Door het bijhouden van celdeling resten tijdens de vroege ontwikkeling van het C. elegans embryo, konden we onlangs bekend dat zij volgen een stereogetypte pad en zijn belangrijke factoren polariserende 13,14. Hier worden protocollen gepresenteerd waaruit kwantitatieve ontwikkelingsbiologie benaderingen toegankelijk voor niet-experts. De focus ligt op drie straight-forward, vrij beschikbare tools die implementeerbaar in een lab dat de toegang tot standaard confocale microscopie en computers heeft zijn. Deze omvatten een protocol om 3D cel vormen te genereren, een protocol bij de celdeling resten volgen en een protocol om corticale actomyosine dynamiek kwantitatief te beschrijven. De nematode C. elegans wordt gebruikt als een typisch geval echter de methoden en instrumenten die hier besproken zijn geschikt voor een verscheidenheid van vragen in andere biologische modellen, bijvoorbeeld gekweekte cellen, weefsel explantaten, organoids of sferoïden andere embryo&#39;s, etc. In het algemeen, een aantal van de hier getoonde analyses kunnen ook worden uitgevoerd met de populaire open source tool ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; of Fiji, de &#39;batterijen&#39; versie van ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) waarvoor veel plugins voor verschillende kwantitatieve analyses beschikbaar zijn. Echter, de programma&#39;s die hier besproken zijn ontworpen om specifieke problemen aan te pakken. Allereerst IMD, een beeldverwerking, modelleren en weergave suite kan worden gebruikt voor 3D-reconstructies van seriële coupes van elektron of lichtmicroscopie 15. IMOD bevat ook gereedschappen voor het bekijken van de 3D-gegevens uit elke richting. Ten tweede, Endrov, een Java-programma dat is ontworpen om beeldanalyse, data verwerking en annotatie van netwerken of tracks (onder andere) aan de hand van een uitgebreide plugin architectuur te voeren, met ImageJ plugin compatibiliteit 16. Het bevat meer dan 140 image-verwerking en een uitbreidbare gebruikersinterface in welk model en ruwe data afzonderlijk worden weergegeven. De broncode is te vinden op https://github.com/mahogny/Endrov. Ten derde PIVlab een MATLAB hulpmiddel voor digitale Particle Image Velocimetry dat de gebruiker toelaat om deeltjes vloeivelden 17 kwantitatief en kwalitatief te analyseren. Het gebruik van deze programma&#39;s vereist een MATLAB licentie die de Image Processing Toolbox (http://mathworks.com) omvat. PIVlab is een programma ontworpen om kwantitatief te beschrijven flow. Het berekent de snelheid distributie, magnitude, vorticiteit, divergentie of afschuiving binnen het paren of reeksen. Hiervoor is cross-correlatie kleine gebieden afbeeldingen (zogenaamde &quot;passen&quot; in het protocol) van een beeldpaar de meest waarschijnlijke deeltje verplaatsing ontlenen. Dit kruiscorrelatie levert een correlatiematrix die in de ruimte of frequentiedomein met behulp van rechtstreekse kruiscorrelatie of een snelle Fourier transformatie (FFT), respectievelijk kunnen worden geanalyseerd. De apparatuur die hier gebruikt is een omgekeerde microscoop uitgerust met een Nipkow (&#39;spinnen&#39;) disc, een EMCCD, 488 en 561 nm standaard solid-state lasers, en 20x lucht of 40x en 60x plannen / Apochromat olie- of water-immersie doelstellingen. Het is echter ook mogelijk om time-lapse imaging voeren met andere beeldvormende modaliteiten, bijvoorbeeld punt-, lijn- of blad-scanning laser microscopie gebaseerde multi-foton microscopie, en epi-fluorescentie microscopie gecombineerd met deconvolutie of gestructureerde verlichting. Het voordeel van een Nipkow schijfsysteem is de extreem snelle beeldacquisitie, vooral als een streamingmodus (continue beweging en scannen van het object in de z dimensie) beschikbaar. Bovendien, om de resolutie te verbeteren, kan een 1,5-voudige vergroot extender voor het EMCCD gebruiken.

<table><tbody><tr><td>Stereo microscope</td><td>Motic/VWR</td><td>OT4005S</td><td>Stereo microscope voor dissectie en montage</td></tr><tr><td>Polybead Polystyrene Microspheres, </td><td>Polysciences</td><td>18329</td><td>Embryo montage</td></tr><tr><td>20 &micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Polystyrene Microspheres, </td><td>Polysciences</td><td>876</td><td>Volwassen dier montage</td></tr><tr><td>0.1 &micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR</td><td>631-0902</td><td>Volwassen dier montage</td></tr><tr><td>Cover glass 18x18 mm</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td>Embryo/volwassen montage</td></tr><tr><td>Cover glass 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1339</td><td>Embryo montage</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>VWR</td><td>233-5455</td><td>Embryo dissectie</td></tr><tr><td>Silicone tubing</td><td>VWR</td><td>228-1501</td><td>Slang voor mondpijp</td></tr><tr><td>30 mm PTFE membraanfilter</td><td>NeoLab</td><td>Jul-01</td><td>Filter voor mondpijp</td></tr><tr><td>Kapillare buizen</td><td>VWR</td><td>621-0003</td><td>Pipettip voor mondpijp</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Roth</td><td>E746.1</td><td>Embryo/volwassen montage</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Roth</td><td>5210.5</td><td>Volwassen dier montage</td></tr><tr><td>Potassium-di-waterstoffosfaat</td><td>Roth</td><td>P018.2</td><td>M9 buffer</td></tr><tr><td>Di-natrium-waterstoffosfaat</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td>M9 buffer</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>M9 buffer</td></tr><tr><td>VisiScope Spinning Disc Confocal System</td><td>Visitron Systems</td><td>n/a</td><td>Confocale microscopie</td></tr></tbody></table>

tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; c. elegans</em&gt; het gebruik van open-source tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Kwantitatief vastleggen van ontwikkelingsprocessen is cruciaal om mechanistische modellen en belangrijke ontlenen aan mutante fenotypes te identificeren en te beschrijven. Hier protocollen worden gepresenteerd voor het bereiden van embryo&#39;s en volwassen C. elegans dieren voor de korte en lange termijn time-lapse microscopie en methoden voor het opsporen en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen. De gepresenteerde methoden zijn allemaal gebaseerd op C. elegans stammen beschikbaar in het Caenorhabditis Genetics Center en open source software die gemakkelijk kan worden geïmplementeerd in elk laboratorium onafhankelijk van de gebruikte microscoop. Een reconstructie van een 3D-cel-vorm model met behulp van het modelleren software IMOD, handmatig bijhouden van fluorescent-gelabelde subcellulaire structuren met behulp van de multi-purpose beeldanalyse programma Endrov, en een analyse van de corticale contractie stroom met behulp PIVlab (tijdsopgeloste Digital Particle Image Velocimetry tool voor MATLAB) getoond. Er wordt besproken hoe deze werkwijzen ook kunnen worden ingezet to kwantitatief vast te leggen andere ontwikkelingsprocessen in verschillende modellen, bijvoorbeeld, mobiele tracking en lineage tracing, het bijhouden van blaasje flow.

Door het gebruik van protocollen 2, 3, en 4, time-lapse beeldvorming van de geslachtsklieren in wild-type C. elegans volwassenen wordt uitgevoerd (stam OD58 (UNC-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1; pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), het uitdrukken van een membraan marker uit een kiemlijn promotor ). Gericht op het begin van de gonade, wordt een 3D-model van de kiemcellen gegenereerd uit de data microscopie (figuur 2). Dit model maakt het mogelijk om veranderingen in celgrootte analyseren...

Hier wordt getoond hoe ontwikkelingsprocessen in C. elegans kunnen worden gevolgd en gekwantificeerd. De gepresenteerde methoden zijn gebaseerd op open-source tools die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd. Het wordt gedemonstreerd hoe 3D-celvormmodellen kunnen worden gereconstrueerd, hoe subcellulaire structuren handmatig kunnen worden gevolgd en hoe corticaal contractiele stroom kan worden geanalyseerd.

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Het algemene doel van het gebruik van software voor beeldanalyse en ontwikkelingsbiologie is het verkrijgen van kwantitatieve gegevens voor mechanistische modellen van biologische processen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals hoe mutante fenotypes kwantitatief kunnen worden geanalyseerd. Het belangrijkste voordeel van deze methodologie is dat het onderzoekers in staat stelt om veranderingen in biologische processen en ontwikkelingsverschijnselen op een onbevooroordeelde manier te identificeren.Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de ontwikkeling en morfogenese van sea elegance, kan deze ook worden toegepast op andere modelorganismen zoals josepha. De reconstructie van de celvorm met IOD zal worden gedemonstreerd door CINA Leman, een promovendus in mijn laboratorium. Open na het installeren van het IM MOD-programma de eunuch shell en typ Im mod in het IM mod-venster. Selecteer het bestand met de juiste ruwe gegevens waaruit een 3D-model moet worden gegenereerd en gebruik het informatievenster om de onder- en bovenkant van de objecten in het zap-venster te lokaliseren.Trek in het informatievenster

tracking-quantifying-developmental-processes-c-elegans-using-open

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

We hebben een video-rate volgen microscoop systeem dat kan opnemen en te...

C. elegans Tracking en Behavioral Measurement

Deze video beschrijft het gebruik van video- en trackingsoftware om wormbewegingen in een arena op te nemen.  Het voorbeeldprotocol meet het effect van blootstelling aan ethanol op de voortbeweging van wormen.

C. elegans Bewegingstracking: een methode om voortbeweging in wormen te beoordelen

Een semi-automatische micro-electro-fluidisch methode om on-demand motoriek induceren...

Microfluïdische-based Electrotaxis voor On-demand Kwantitatieve analyse van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Prion-achtige verspreiding van eiwitaggregaten is recent naar voren gekomen als een factor die bij veel neurodegeneratieve ziekten betrokken is. Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe de rondworm C. elegans als modelsysteem kan worden gebruikt om eiwitverspreiding te volgen en prion-achtige fenomenen te onderzoeken.

Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme<em&gt; C. elegans</em

Een efficiënte en eenvoudige methode voor het computer-gebaseerde analyse van nematode zwemmen gedrag in de vloeistof wordt beschreven. De methode vereist weinig tot geen investering voor C. elegans laboratoria. De gebruikte hardware is standaard, en de computer software voor de gedragsanalyse (celest) is een open source is.

Geautomatiseerde analyse van<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Gedrag Met behulp van Celest Software

Hier presenteren we een kader hebben betrekking op breed scala dieet beperking genexpressie en levensduur. We beschrijven de protocollen voor breed scala dieet beperking en voor kwantitatieve beeldvorming van genexpressie onder dit paradigma. We schetsen verder computationele analyses te onthullen de functies van information processing van de genetische circuits onderliggende betrokken bij voedsel-sensing.

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans

We beschrijven de protocollen voor het gebruik van het brede veld-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), waarmee de fenotypische karakterisering van de high-throughput van grote populaties van Caenorhabditis elegans. Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor subtiele gedragsveranderingen in gemuteerde stammen of in reactie op farmacologische behandeling in een uiterst schaalbaar mode karakteriseren.

Geautomatiseerde Behavioral analyse van grote C. elegans populaties met behulp van een breed veld-of-view Tracking Platform

Hier presenteren we een combinatie benadering met behulp van hoge-resolutie microscopie, computationele tools, en single-cell etikettering in levende C. de embryo's van de neurologische om de enige cel dynamiek te begrijpen.

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Deze studie presenteert protocollen voor twee semi-geautomatiseerde locomotorische activiteitsanalysebenaderingen in C. elegans complex I ziekte gas-1(fc21) wormen, namelijk ZebraLab (een medium-throughput assay) en WormScan (een high-throughput assay) en biedt vergelijkende analyse tussen een breed scala aan onderzoeksmethoden om het gedrag van nematoden en de geïntegreerde neuromusculaire functie te kwantificeren.

Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in Caenorhabditis elegans-modellen van mitochondriale ziekte te kwantificeren

Leer hoe u ontwikkelingsprocessen in C. elegans kunt volgen en kwantificeren met open-source tools zoals IMOD en NDR. Deze methode maakt 3D-celreconstructie en onbevooroordeelde fenotype-analyse mogelijk.

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in

Meer video's verkennen