Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

Deze methodologievideo introduceert de cruciale stappen van immunostaining- en chromatine-immunoprecipitatieprotocollen die regelmatig worden gebruikt om DNA-schadegerelateerd cellulair proces te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren. Deze techniek biedt krachtige tools voor de onderzoekers om nieuwe eiwitten te identificeren die gebonden zijn aan de beschadigde genomische locus, evenals hun post-translationele modificaties die nodig zijn voor de nauwkeurig afgestemde regulatie tijdens DNA-reparatie. Aangezien deze technieken kunnen worden toegepast voor het bestuderen van verschillende cellulaire processen, hebben ze potentiële relevantie als een lasermicroirradiatie of de op kernen gebaseerde DNA-schadelijke inducerende systemen worden gebruikt.

Onlangs zijn verschillende krachtige tools ontwikkeld om locatiespecifieke DNA-schade te veroorzaken die kan worden gebruikt om ons begrip van DNA-reparatie uit te breiden. Door biochemische en genetische benaderingen toe te passen, zijn deze gebruiksvoorwerpen essentieel bij het onthullen van cellulaire gebeurtenissen die verband houden met de rekrutering en assemblage van DNA-reparatiecomplexen op de plaats van DNA-schade. Bovendien maken deze technieken het mogelijk om deze processen met één celresolutie te bestuderen met behulp van zowel vaste als levende cellen.

Onderhoud U2OS-cellen in monolagen in DMEM-kweekmedium aangevuld met 10% foetale kalfsserum, 2 millimolar glutamine en de 1% antibioticum-antimycotische oplossing. Kweek cellen in een bevochtigde 5% kooldioxide-omgeving met 37 graden totdat 80% samenvloeiing wordt bereikt, waardoor het medium elke twee tot drie dagen wordt vernieuwd. Aspireer het medium en was de cellen met PBS.

Maak cellen los met trypsine-EDTA-oplossing. Wanneer de cellen losraken, stop dan de activiteit van de trypsine door kweekmedia aan de cellen toe te voegen, wat een celsuspensie oplevert. Tel de cellen met behulp van een celtelkamer.

Plaat 20.000 cellen per milliliter per put op de 24-putplaat met steriele 12 millimeter ronde afdekslips in elke put. Incubeer cellen gedurende 24 uur op 37 graden in een bevochtigde omgeving van 5% kooldioxide om bevestiging op de afdekkingsslips mogelijk te maken. Behandel de cellen met 10 nanogram per milliliter neocarzinostatine of gebruik de juiste methode om dubbelstrengsbreuken te induceren via systemen op basis van endonucleuse.

Incubeer cellen gedurende één tot acht uur bij 37 graden in een bevochtigde koolstofdioxideomgeving van 5% om de kinetiek van de DNA-reparatie te volgen. Fix cellen met 4% formaldehyde PBS-oplossing gedurende 20 minuten op 25 graden. Verwijder de bevestigingsoplossing en was de cellen drie keer met PBS gedurende elk vijf minuten.

Verwijder de PBS en voeg 0,2%Triton X opgelost in PBS toe. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten. Was de cellen drie keer met PBS.

Blokkeer de niet-specifieke binding met 5% BSA verdund in BSA-PBST en incubeer de monsters gedurende ten minste 20 minuten. Voeg de juiste hoeveelheid primair antilichaam verdund toe in 1%BSA-PBST-oplossing. Plaats elke afdeklip ondersteboven op een parafilm of 10 microliter druppel van het verdunde antilichaam.

Incubeer de monsters in een vochtigheidskamer gedurende anderhalf uur op vier graden. Plaats de afdekkingsslips met de zijkant naar boven in de 24-putplaat en de was drie keer met PBS. Voeg de juiste hoeveelheid secundair antilichaam verdund toe in 1%BSA-PBST.

Plaats elke hoes ondersteboven op parafilm over een druppel van 10 microliter van het verdunde antilichaam. Incubeer de monsters een uur lang in een vochtigheidskamer op vier graden. Plaats de terugglijders terug in de 24-putplaat en was driemaal met PBS.

Voordat u de laatste PBS-wasoplossing verwijdert, verwijdert u voorzichtig de afdekslips met de helft van het pincet en de naald en plaatst u deze vervolgens ondersteboven op de glazen dia's met druppels montagemedium. Chromatine immunoprecipitatie is een veelgebruikte techniek om bindingspatronen van eiwitten aan DNA te identificeren. Om de bezetting van een wensherstel-eiwit rond de DSB te onthullen, wordt een specifiek antilichaam gebruikt om het interesseeiwit van het chromatinepreparaat samen met het DNA-gebied waaraan het is gebonden, te immunoprecipitaat.

Bovendien is ChIP vaak toegepast om de aanwezigheid van specifieke post-translationele modificatie in het gebruik door DSB's op een bepaalde genomische locus in kaart te brengen. Ongeveer 20 miljoen cellen per milliliter moeten worden gekweekt in een schaal van 15 centimeter voor elk monster. Verwijder kweekmedium en was de cellen twee keer met ijskoud PBS.

Bevestig de cellen met 1%formaldehyde-PBS oplossing. Plaats de plaat op een orbitale shaker en roer zachtjes gedurende 20 minuten. Stop de fixatie met glycine om een eindconcentratie van 125 millimolar te bereiken en incubeer op een orbiter shaker met zachte agitatie gedurende vijf minuten op 25 graden.

Leg de plaat op ijs en was twee keer met ijskoude PBS. Schraap de cellen in ijskoud PBS en breng ze over in 15 milliliter conische buizen. Centrifugeer de cellen bij 5.000 tpm gedurende vijf minuten bij vier graden.

Aspireer voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in twee milliliter cellysebuffer en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer bij 5.000 tpm gedurende vijf minuten bij vier graden. Gooi het supernatant voorzichtig weg en resuspendeer de pellet in 500 tot 1.500 microliter nucleaire lysisbuffer en incubeer gedurende 30 tot 60 minuten op ijs.

Breng het lysaat over in een polystyreen conische buis die geschikt is voor sonicatie. Soniceer het lysaat om het DNA te scheren tot een gemiddelde fragmentgrootte van 300 tot 1000 basisparen. Bereid Dynabeads voor op de pre-reinigings- en immunoprecipitatiestappen.

Was kralen twee keer gedurende 10 minuten op vier graden met RIPA buffer. Resuspend Dynabeads in hetzelfde volume RIPA-buffer als u in stap 3.1 uit de oorspronkelijke voorraadoplossing hebt genomen. Pre-clear 25 tot 30 microgram chromatine van elk monster met vier microliter Dynabeads via rotatie gedurende één tot twee uur bij vier graden.

Zet de Dynabeads met een magneet neer en breng het supernatant over naar een nieuwe Eppendorf-buis. Voeg de juiste hoeveelheid antilichaam toe aan elk chromatinemonster en roteer 's nachts op vier graden. Voeg de volgende dag 40 microliter gewassen Dynabeads toe aan elk monster en incubeer ze 's nachts draaiend op vier graden.

Was eenmaal met 300 microliter zoutarme buffer gedurende 10 minuten met rotatie op vier graden. Was eenmaal met 300 microliter zoutrijke buffer gedurende 10 minuten met rotatie op vier graden. Was eenmaal met 300 microliter lithiumchloride buffer gedurende 10 minuten met rotatie op vier graden.

Was tweemaal met 300 microliter TE gedurende 10 minuten met rotatie voor de eerste wasbeurt op vier graden en de tweede was op 25 graden. Voeg 200 microliter elutiebuffer toe aan de kralen en incubeer ze op 65 graden in een thermo-shaker gedurende 15 minuten met continu schudden. Breng het supernatant weer over naar een nieuwe tube en elute kralen in 200 microliter elutie buffer.

Voeg 500 microgram per milliliter proteinase-K en een half procent SDS toe en incubeer de monsters gedurende twee uur op 50 graden. Voer chloroformextractie uit en breng de bovenste waterfase over naar een nieuwe Eppendorf-buis. Voeg twee en een half volume absolute ethanol en 0,1 volume drie molair natriumacetaat pH 5,2 toe.

Incubeer minstens 20 minuten bij min 80 graden. Verwijder de ethanol en droog de pellet aan de lucht. Resuspend de pellet in 50 microliter TE. Om hun speciale verdeling op DNA te bestuderen, moet chromatine immunoprecipitatie worden toegepast.

Een typische experimentele resultaten verkregen door ChIP-qPCR wordt gepresenteerd in deze figuur, die de tijdelijke verrijking van gamma histon AX aantoont als een reactie op I-PpoI-geïnduceerde DNA-schade. Aan de linkerkant van de afbeelding wordt het tijdig gedetecteerde gamma-histon AX-signaal aan de breukzijde weergegeven, terwijl aan de rechterkant de gamma-histon AX-verdeling wordt gepresenteerd in het controlegengebied waar geen aangetoonde breuken zijn geïnduceerd. Hoewel DNA-reparatie een relatief recent onderzoeksveld is, neemt onze kennis snel toe met behulp van zowel biochemische als microscopische methoden.

Niettemin vereisen biochemische technieken, zoals een westerse vlek, immunoprecipitatie en massaspectrometrie, een grote hoeveelheid cellen. De reparatieprocessen van de studie vertegenwoordigen een momentopname van de gewenste celpopulatie. Het microscopische veld is gerevolutioneerd door technieken met hoge resolutie, zoals een superresolutiemicroscoop, die de visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde cellulaire processen op nucleosoomniveau mogelijk maakt en zorgt voor een nauwkeurige mapping van eiwitcolokalisatie.

Aan de andere kant is chromatine immunoprecipitatie een krachtig hulpmiddel, vooral door het te combineren met sequencingmethoden om het genoombrede bindingspatroon van een gewenst DNA-reparatiegerelateerde eiwitten en dubbele strengbreuken in een chromatine- of heterochromatineregio te visualiseren.