De E1A Minigene Tool gebruiken om mRNA-splicingwijzigingen te bestuderen

Het algemene doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te bieden voor het gebruik van het minigene E1A2 voor het evalueren van wereldwijde mRNA-splicingwijzigingen. Dit is een snel, goedkoop en eenvoudig hulpmiddel voor het beoordelen van de functie van het doeleiwit in alternatieve splicing-regelgeving zonder de noodzaak van speciale regimes of laboratoriumomstandigheden. Begin met het cultiveren van HEK 293 cellen met stabiele expressie van het gen van belang.

Splits de cellen met 0,25% trypsine EDTA, plaat vervolgens 300.000 cellen per put in zes-put platen en incubeer ze gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide. Controleer na 24 uur de samenvloeiing en transfect hek 293 stabiele cellen alleen wanneer 70 tot 80% samenvloeien. Verwijder voorzichtig het celkweekmedium met een pipet, voeg vervolgens twee milliliter compleet DMEM-medium zonder antibiotica toe en plaats de plaat terug in de incubator.

Bereid een buis voor met de transfectiebuffer, voeg vervolgens twee microgram pMTE1A DNA, vortex toe en voeg twee microliters transfectiereagens toe. Draai opnieuw en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Haal de platen uit de incubator en voeg voorzichtig het transfectiemengsel druppelgewijs toe.

Voeg zes uur na de transfectie tetracycline toe aan HEK 293 stabiele cellen voor Nek4 expressie inductie. 24 uur na de transfectie, controleer de celmorfologie en transfectie-efficiëntie met behulp van een fluorescerende microscoop. Gebruik een pipet om het celkweekmedium te verwijderen en voeg vervolgens celkweekmedium toe met de chemotherapeutica.

Incubeer de cellen nog 24 uur. Om RNA te verzamelen, gooit u het celkweekmedium weg en voegt u 0,5 tot 1 milliliter RNA-extractiereagens rechtstreeks aan de put toe. Als putten zeer samenvloeiend zijn, gebruik dan één milliliter RNA-extractiereagens om de RNA-kwaliteit te verbeteren.

Homogeniseer de cellen met een pipet en breng ze over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Ga onmiddellijk naar de RNA-extractie of bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius. Ontdooi de monsters in een zuurkast en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Voeg 0,1 tot 0,2 milliliter chloroform toe en roer krachtig en incubeer vervolgens gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12,000 keer G en vier graden Celsius, verzamel vervolgens de bovenste waterfase en breng deze over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter. Verzamel ongeveer 60% van het totale volume, maar verzamel niet het DNA of de organische fase.

Voeg 0,25 tot 0,5 milliliter isopropanol toe en roer het monster vier keer door omkering. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, centrifugeer vervolgens op 12.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Was de RNA-pellet twee keer met ethanol en centrifugeer gedurende vijf minuten op 7,500 keer G en gooi de ethanol weg.

Verwijder overtollige ethanol door de buis op een papieren handdoek om te keren en laat de buis vervolgens open in een zuurkast om de pellet gedurende vijf tot tien minuten gedeeltelijk te drogen. Hang de RNA-pellet opnieuw op in 15 microliters MET DEPC behandeld water. Kwantificeer het totale RNA en verifieer de RNA-kwaliteit door de absorptie te meten op 230, 260 en 280 nanometer.

Om de totale RNA-kwaliteit te controleren, voert u gedurende 30 minuten een 1% agarosegel uit die is voorbehandeld met 1,2% van een 2,5% natriumhypochlorietoplossing. Voer de cDNA-synthese uit met één tot twee microgram totaal RNA. Combineer RNA, één microliter oligo d-T, één microliter DNTP en nucleasevrij water tot 12 microliter.

Incubeer de reactie in de Thermo Cycler gedurende vijf minuten bij 65 graden Celsius. Verwijder monsters uit de Thermo Cycler en voeg vier microliters reverse transcriptasebuffer, twee microliters DTT en één microliter ribonucleaseremmer toe. Incubeer twee minuten op 37 graden Celsius.

Voeg een microliter thermo-stabiele reverse transcriptase toe en incubeer gedurende 50 minuten bij 37 graden Celsius. Inactiveer het enzym gedurende 15 minuten op 70 graden Celsius. Voer PCR uit zoals beschreven in het teksthandschrift, laad vervolgens 20 tot 25 microliter van het PCR-product op een 3% agarosegel die nucleïnezuurvlek bevat en voer ongeveer een uur op 100 volt.

Fotografeer de gel, vermijd eventuele bandverzadiging en kwantificeer de banden met behulp van een beeldverwerkingssoftware. De banden op respectievelijk 631, 493 en 156 basisparen komen overeen met de 13S-, 12S- en 9S-isovormen. Open het afbeeldingsbestand in het menu Bestand van de software en converteer het naar grijswaarden.

Pas helderheid en contrast aan en verwijder indien nodig uitschietergeluiden. Teken een rechthoek rond de eerste rijstrook met het gereedschap Rechthoekselectie en selecteer deze via de opdracht Analyseren, Gels en Eerste rijstrook selecteren of met de sneltoets. Gebruik de muis om te klikken en houd in het midden van de rechthoek op de eerste rijstrook en sleep deze naar de volgende rijstrook.

Ga naar Analyseren, Gels en Selecteer Volgende rijstrook. Herhaal deze stap voor alle resterende rijstroken. Nadat alle rijstroken zijn gemarkeerd en genummerd, gaat u naar Analyze, Gels en Plot Lanes om een profielplot van elke rijstrook te tekenen.

Gebruik het gereedschap Rechte lijnselectie om een lijn over de basis van elke piek te tekenen, die overeenkomt met elke band, waarbij het achtergrondgeluid wordt weggelaten. Nadat alle pieken van elke rijstrook zijn afgesloten, selecteert u het toverstokje en klikt u in elke piek. Metingen moeten verschijnen in het resultatenvenster voor elke gemarkeerde piek.

Houd alleen rekening met de 13S-, 12S- en 9S-pieken die overeenkomen met 631,493 en 156 basisparenbanden. Kopieer intensiteitsgegevens voor een spreadsheeteditor en som de intensiteit van alle drie de banden voor elk monster op en bereken vervolgens het percentage voor elke isovorm ten opzichte van het totaal. Plot de percentages van elke isovorm of de verschillen in het percentage ten opzichte van de onbehandelde monsters.

Een plasmide met het minigeen uit E1A werd gebruikt om het effect op alternatieve splicing waar te nemen door het aandeel mRNA van elke geproduceerde isovorm te evalueren. Basale expressie van E1A-isovormenvarianten was afhankelijk van de cellijn en tijd van de E1A-expressie. De HEK 293 stabiele cellijn, of HEK 293 recombinase bevattende site, vertoonde een hogere expressie van 13S in vergelijking met HeLa-cellen, maar vertoonde vergelijkbare niveaus van 13S en 12S isovormen na 48 uur E1A-expressie.

Cellen blootgesteld aan cisplatine vertoonden een verschuiving in vijf priem S-S splicing selectie ten gunste van 12S expressie. Dit effect werd waargenomen in HEK 293 die de lege vector van de Vlag stabiel uitdrukte, evenals isoforme van Nek4. Veranderingen in alternatieve splicing na paclitaxel behandeling waren zeer discreet, maar de richtingen van de veranderingen waren tegenovergesteld in Flag en Nek4 uitdrukkende cellen.

Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om niet-getransfecteerde en niet-omgekeerde transcriptasebesturingselementen te gebruiken om verkeerde interpretatie met endogene E1A-expressie te voorkomen, voornamelijk bij het gebruik van HEK 293-cellen. Na het verkrijgen van positieve resultaten kan de alternatieve verlening van specifieke genen gerelateerd aan de chemotherapeutische respons worden geëvalueerd. Wanneer enig effect wordt waargenomen, kan dit eenvoudige protocol deze studies sturen voor meer consistente trajecten, waarbij het eiwit een rol speelt bij het reguleren van alternatieve splicing in chemotherapierespons, bijvoorbeeld.