Multi-timescale microscopiemethoden voor de karakterisering van fluorescerend gelabelde microbubbels voor echografie-getriggerde medicijnafgifte

Dit protocol kan worden gebruikt om de respons te karakteriseren van fluorescerend gelabelde microbubbels die zijn ontworpen voor echografie-geactiveerde medicijnafgiftetoepassingen die de activeringsmechanismen en bio-effecten omvatten. De sleutel ligt in de combinatie van beeldvormingstechnieken die ons in staat stelt om het multi-schaal probleem van ultrasoon getriggerde medicijnafgifte met bubbels te ontrafelen, zowel op verschillende ruimtelijke schalen als op verschillende tijdschalen. Voor beeldvorming met één bel door Brightfield-microscopie plaatst u een ontluchtingsnaald van 19 gauge en gebruikt u een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 19 gauge om een kleine hoeveelheid van de microbubbelsuspensie uit de glazen injectieflacon in een kleine buis te verwijderen voor gemakkelijker pipetteren in de volgende stap.

Verdun met behulp van een pipet de microbubbeloplossing in gefilterde fosfaat gebufferde zoutoplossing. Gebruik een spuit van 10 milliliter om het monster in één uitlaat van de monsterhouder te injecteren totdat de houder vol is zonder luchtbellen te creëren, en injecteer indien nodig meer van het monster. Sluit beide kleppen van de monsterhouder en plaats de monsterhouder loodrecht op de optische as van de microscoop.

Stel vóór de monsteranalyse de gewenste ultrasone rijfrequentie en akoestische druk in op de willekeurige golfvormgenerator en begin met het gezichtsveld in een hoek van de monsterhouder, gebruik de XYZ-trap om de houder te bewegen om enkele microbubbels in het gezichtsveld van de microscoop te lokaliseren, bevestig vervolgens een optische vezel die is aangesloten op een waterbad op een stroboscooplamp en start de opname. Herhaal de beeldvorming zo vaak als gewenst per ultrasone instelling en verplaats de monsterhouder ten minste twee millimeter naar een gezichtsveld met ongesoniceerde microbubbels voor elke analyse. Voor fluorescentie microscopische beeldvorming van de microbubbels, na het verdunnen van de microbubbeloplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing zoals gedemonstreerd, stelt u de gewenste ultrasone rijfrequentie en akoestische druk in op de willekeurige golfvormgenerator en stelt u de triggervertraging voor de laser in op de pulsvertragingsgenerator voor fluorescentie-excitatie van de nanodeeltjes van de microbubbels, en gebruikt u vervolgens de XYZ-fase om de monsterhouder te bewegen om enkele microbubbels te lokaliseren en ze in de focus van het doel en activeer vervolgens de opname.

Herhaal de beeldvorming naar wens door de ultrasone instellingen te wijzigen en de monsterhouder naar het nieuwe gezichtsveld te verplaatsen zoals gedemonstreerd. Voor beeldvorming door intravitale microscopie plaatst u eerst een verwarmde dierhouder op de XY-positioneringsfase tussen de golfgeleider en het objectief en voegt u koppelingsgel toe aan de golfgeleider. Plaats een staartaderkatheter in de staartader van een verdoofde tumordragende muis en plaats de muis met een vensterkamer in de verwarmde houder.

Voeg een waterdruppel toe aan de deklip. Om de vasculatuur van het tumorweefsel te visualiseren, injecteert u intraveneus 30 microliter van vier milligram per milliliter fluorescerend gelabeld 2 megadalton dextran in de staartaderkatheter en gebruikt u de XY-translatiefase om de muis te bewegen totdat een gezichtsveld met geschikte bloedvaten kan worden gelokaliseerd. Pas de framesnelheid, het gezichtsveld en de lengte van de opname aan volgens de parameters van het experiment en neem basislijnbeelden van de vaten op.

Wanneer de basislijnbeelden zijn verkregen, stelt u de ultrasone rijfrequentie, pulslengte en akoestische drukamplitude in op de willekeurige golfvormgenerator en injecteert u intraveneus 50 microliter microbubbelmonster in de staartader. Stel je dan de vasculatuur voor zoals gedemonstreerd. Analyse van de microbubbels door confocale fluorescentiemicroscopie onthult een niet-uniforme deeltjesverdeling van de microbubbelschaal.

De totale structuur van de microbubbels kan verder worden gevisualiseerd door scanning elektronenmicroscopie. Analyse van de radiale dynamica en het fenomenologische gedrag van geïnsoneerde microbubbel door Brightfield-microscopie maakt de waardering van de relatieve verandering in de microbubbelstraal in de loop van de tijd mogelijk. Hier wordt een beeldsequentie getoond van een typische succesvolle levering van fluorescerend gelabelde nanodeeltjes.

De nanodeeltjes ingebed in de microbubbelschaal kunnen worden waargenomen om te fluoresceren wanneer het laserlicht de bel bereikt. Zoals waargenomen bij deze mislukte levering, lichten de fluorescerende nanodeeltjes echter op de schaal van de microbubbel, die intact blijft tijdens de ultrasone blootstelling. Intravitale multi-foton beeldvorming kan worden gebruikt om de ruimtelijke en temporele extravasatie van de nanodeeltjes tijdens ultrasone blootstelling te bepalen, wat gunstig kan zijn voor het begrijpen en optimaliseren van de mechanismen die ten grondslag liggen aan echografie-gemedieerde nanodeeltjesafgifte.

Met de perfecte uitlijning van de optische en akoestische paden op alle lengte- en tijdschalen, wordt een uitgebreid inzicht in echografie-getriggerde medicijnafgifte geboden. De antwoorden van onze multi-scale experimenten zullen nu worden vertaald naar de klinische praktijk. De resultaten zullen waardevolle inzichten bieden voor een reeks therapeutische toepassingen, waaronder kankertherapie.