NMR-gebaseerde fragmentscreening in een minimale steekproef maar maximale automatiseringsmodus

We voeren kernspinresonantiestudies uit. Dit stelt ons in staat om de structuren van eiwitten, RNA en DNA in oplossing te bepalen. Deze biomoleculen zijn de bestanddelen, zijn de componenten van onze cellen, en onze protocollen die we hier presenteren houden zich bezig met het screenen van kleine moleculen en hun binding aan deze doelen.

Uit deze moleculen kunnen onze medicinale chemie en structuurbiologie nieuwe medicijnen afleiden die ziekten bestrijden. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat we volledige controle hebben over de kwaliteit van de moleculaire doelen, zoals de eiwitten, en we hebben volledige controle over de kwaliteit van de fragmenten en medicijnen van kleine moleculen, en we kunnen ook eiwitten screenen op binding van een breed scala aan affiniteiten, wat een voordeel is in vergelijking met andere methodologieën. Om zeefmonsters voor NMR-meting voor te bereiden, gebruikt u een monstervoorbereidingsrobot om 768 verbindingen in acht 96-putplaten te verdelen om 64 mengsels met 12 fragmenten te verkrijgen tot een uiteindelijke concentratie van 4,2 millimolar per mengsel.

Breng het biomoleculaire doelwit van belang, verdund in een geschikte screeningbuffer, over in het juiste aantal barcode-drie millimeter NMR-monsterwisselaarbuizen met hoge doorvoer en gebruik de robot om 10 microliter van elk ligandmengsel over te brengen in elke buis van het doelbiomolecuul. Laat de robot vervolgens de oplossingen grondig mengen. Voor NMR-acquisitie laadt u het monster in de spectrometer.

Open de spectrometersoftware en selecteer vervolgens de parameterset en pulssequenties voor op ligand gebaseerde experimenten. Voor alle vermelde experimenten selecteert u excitatiesculptuur als de wateronderdrukking. Voor fluor-19-screening selecteert u zowel 1D- als T2-experimenten.

Selecteer de spectrale breedte tot 220 delen per miljoen, de excitatiefrequentie tot 140 delen per miljoen en de analysetijd tussen één en vijf uur. Voor T2 moet de CPMG-tijd afwisselend tussen 5 en 100 milliseconden liggen. Neem de T1r- en T2-experimenten op.

Noteer het verschil in verzadigingsoverdracht als een pseudo-2D. Om de twee afzonderlijke 1D-spectra te verwerken, gebruikt u de AU-programma ProcStd-functie, met of zonder de relaxoptie. De WaterLOGSY is een enkele 1D die gefaseerd moet worden met een negatief voor het oplosmiddelsignaal.

Om de waterstofscreeninggegevens te analyseren, volgt u de instructies voor de op fragmenten gebaseerde screeningstool om de biomoleculaire magnetische resonantie NMR-gegevens van screeningcampagnes op te slaan, zodat elk screeningsmengsel zijn directory heeft waarin een subdirectory de verschillende experimenten bevat die op het monster zijn gemeten. Sla de referentiespectra op, waarbij alle gegevens van de monsters zijn opgeslagen zonder het biomoleculaire doelwit, maar met de mengsels en de enkele verbinding in verschillende mappen. Maak een direct pad naar de map met de verkregen gegevens en selecteer de NMR-map waarin alle mengsels een afzonderlijke map moeten hebben.

Zorg ervoor dat het CSV-, fragmentscherm, XML-document en BAC-bestanden ook worden gekopieerd naar de NMR-map van de gegevens. Als u het op fragmenten gebaseerde screeningsgereedschap voor een gescreend monster wilt gebruiken, sleept u het op fragmenten gebaseerde screeningsprojectsymbool naar het midden van het analysevenster. Het symbool moet worden weergegeven als de eerder opgeslagen gegevenssets erin zijn gekopieerd.

Het venster met op fragmenten gebaseerde screeningopties wordt automatisch geopend. Selecteer een CSV-cocktailbestand met de namen van de mixen, de namen van elk fragment en de verdeling van elk fragment in de mixen. Definieer een referentie ligand spectra map met alle gemeten spectra van de afzonderlijke fragmenten, en definieer een referentie lege experiment map, die meestal de datasets van de mixen zonder het onderzochte doel bevat.

Als u de onderzochte spectra en spectraweergavekleuren wilt definiëren, opent u het tabblad Spectratypen en stelt u het specificatietype in op basis van de procesgegevens. Definieer op het tabblad Weergave-indeling de spectra die worden vergeleken op basis van de specificatietypen. Klik vervolgens op OK om het project te starten.

Terwijl de gegevens worden verwerkt, wordt een apart venster geopend met de tabel met een samenvatting van alle cocktailmixen en de liganden van elke mix. Dubbelklik op een cel om de respectievelijke gegevenssets te openen. Voordat u bindmiddelen toewijst, moet u ervoor zorgen dat de referentiepieken overeenkomen met elkaar en dezelfde chemische verschuiving hebben.

Als er verschillen worden waargenomen, opent u het tabblad Proces en gebruikt u de optie voor seriële verwerking om deze te corrigeren. Voor de eerste analyse van de fluor-19-mengsels opent u het tabblad Analyseren en selecteert u de integratiefunctie. Zorg ervoor dat voor elk fragment in het mengsel een duidelijk integratiegebied voor het overeenkomstige fluor-19-signaal is gedefinieerd.

Sla exportintegratiegebieden op om het integratiebestand te exporteren voor toekomstig gebruik en sla alle gebruikte integratiebestanden op in de juiste installatiemap. Voor fluor-19-gegevens opent u een gegevensset met of zonder het onderzochte doel en klikt u op het tabblad Analyseren op Integratiegebieden integreren en lezen om het bijbehorende integratiebestand in het huidige spectrum te laden. Klik vervolgens op Opslaan en terugkeren om een lijst met de geïntegreerde gebieden op het tabblad Integralen te zoeken en kopieer deze informatie naar een spreadsheet voor downstream-analyse.

De moleculaire structuur of samenstelling van de liganden in de fragmentbibliotheek wordt geanalyseerd met behulp van moleculaire betrouwbaarheidssoftware zoals gedemonstreerd, en de resultaten worden gepresenteerd als een grafische uitvoer. Een oranje kleur geeft aan dat het fragment een inconsistentie in structuur of concentratie vertoont. Groengekleurde putjes geven aan dat het fragment consistent is.

In deze representatieve analyse werden 103 fragmenten met een of meerdere fluorgroepen uit de eigen bibliotheek verdeeld in vijf mengsels van 20 tot 21 fragmenten per mengsel. Fluor-19 transversale relaxatie-experimenten werden gemeten voor elk mengsel dat CPMG-pulstreinen toepaste. Drempelwaarden zijn nuttig voor het definiëren van bindmiddel, zwak bindmiddel of niet-bindmiddel in het mengsel, zoals waargenomen in deze typische thiamine-eiwit tyrosinekinase A- en RNA-spectra.

In deze representatieve analyse toonde hit één een T2-afname van ongeveer 50% en een chemische verschuiving groter dan of gelijk aan zes hertz. De WaterLOGSY vertoonde geen significante verandering in het signaal om als positief te worden geteld. Omdat twee van de drie experimenten echter positief waren, werd dit fragment als een hit geteld.

Voor hit twee vertoonde de T2 een afname van ongeveer 80% in signaalintensiteit. Ook voor de WaterLOGSY werd een duidelijke signaalverandering waargenomen. De chemische verschuiving was niet genoeg in dit experiment, maar omdat de twee vorige criteria positief waren, werd het nog steeds als een hit geteld.

Het uiteindelijke doel van dergelijke methoden is om nieuwe medicijnen of hoog-affiniteitsremmers van bijvoorbeeld enzymen te ontwikkelen, en hierin neemt medicinale chemie deze nieuwe moleculen over en synthetiseert deze, maar structuurbiologie, de technieken die je hier toepast, kunnen de medicinale chemie begeleiden en die aanpak veel sneller maken.