Microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen

In deze procedure laten we zien hoe je in enkele minuten van een klein molecuulpoeder naar een driedimensionale structuur kunt gaan. Dit is een transformatieve techniek voor de chemiegemeenschap. Veel verbindingen groeien niet gemakkelijk uit tot grote kristallen.

Met MicroED kunnen we atomaire resolutiestructuren bepalen uit kristallen van nanometergrootte. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Mike Martynowycz, die professor is aan de UCLA. Breng om te beginnen een kleine hoeveelheid poeder, vloeistof of vaste stoffen over in een kleine injectieflacon of buis.

Voor monsters die al in poedervorm zijn, sluit u de buis af met de dop totdat het monster nodig is. Droog de vloeistofmonsters op dezelfde manier in poeders. Wikkel plastic folie rond het ene uiteinde van een glazen afdekplaat.

Plaats de TEM-roosters op de folie bovenop de afdekplaat met de bruine kleur carbon naar boven gericht. Plaats vervolgens de dia met roosters in de gloeiontladingskamer en ontlaad de afdekplaat gedurende ongeveer 30 seconden met behulp van de negatieve instelling op 15 picoampères. Bewaar de roosters op de afdekplaat in een glazen petrischaal bekleed met filterpapier voordat u het monster aan de roosters toevoegt.

Verwijder het TEM-rooster met gloeiafvoer van de afgedekte petrischaal met een pincet en plaats het op een cirkelvormig filterpapier met de koolstofzijde naar boven gericht. Verwijder met een kleine spatel een heel klein schepje poeder en plaats het op een kleine vierkante glazen afdekslip net naast het TEM-rooster op het filterpapier. Plaats nog een kleine vierkante glasplaat of afdekplaat bovenop het poeder.

Wreef met de vingers de twee glasglaasjes zachtjes tegen elkaar om een fijn poeder te maken. Hoek de afdekslip en plaats ze net boven het TEM-raster op het filterpapier en blijf de afdekplaten slechts een paar centimeter boven het gloeiende TEM-rooster tegen elkaar wrijven. Kijk of het poeder naar het rooster valt.

Ontdek het fijngemalen poeder door een van de twee glazen afdekplaten te verwijderen. Borstel vervolgens voorzichtig het fijne poeder van de afdekplaat op het TEM-rooster met behulp van een stuk filterpapier. Pak de rand van het TEM-raster vast met een pincet en zorg ervoor dat de uiteinden geen van de rastervierkanten doorboren.

Til het raster één tot twee centimeter boven het filterpapier en hoek het raster 90 graden ten opzichte van het papier eronder. Tik zachtjes op het pincet terwijl u het rooster stevig getweezed houdt om los poeder te verwijderen. Bevries het rooster door de punt van het pincet met het rooster met de hand rechtstreeks in een container met vloeibare stikstof te verplaatsen en wacht tot het rooster en het pincet stoppen met koken.

Plaats onder vloeibare stikstof het rooster in de monsterhouder met de koolstofzijde zodanig georiënteerd dat het monster vóór de koolstofsteunfilm door de bundel wordt geraakt. Laad de monsterhouder in de TEM en zorg ervoor dat het rooster altijd op vloeibare stikstoftemperaturen wordt gehouden. Voor automatische ladersystemen plaatst u de geknipte roosters in een cassette in een vloeistofstikstofgekoelde container, waardoor de robotica van de autolader de cassette kan accepteren terwijl de monsters veilig blijven voor shuttling tussen de autolader en de kolom.

Open de TEM-kolomkleppen en pas de vergroting met behulp van de handpanelen aan op de laagst mogelijke vergroting. Zoek de bundel door de intensiteitsknop op de handpanelen zo aan te passen dat een rond helder gebied zichtbaar is op het fluorescerende scherm. Neem een all grid atlas bij lage vergroting met behulp van geschikte software die ervoor zorgt dat de microscoop goed is uitgelijnd voor zowel lage als hoge vergrotingsbeeldvorming voordat microED-gegevens met hoge resolutie worden verzameld.

Identificeer rastervierkanten zonder gebroken koolstof en zichtbare zwarte of donkere korrels op de film. Navigeer door het raster fysiek met behulp van de joystick op de handpanelen of virtueel op de verzamelde atlas om te zoeken naar rastervierkanten die niet zijn gebroken en microkristallen bevatten. Voeg het midden van elk van deze vierkanten toe aan een lijst met rasterlocaties voor onderzoek, die kan worden toegevoegd aan een notitieboek in de gebruikersinterface van de microscoop of in de automatiseringssoftware van de microscoop.

Stel de vergroting in tussen 500 en 1300x. Pas de centrale hoogte op elke opgeslagen rasterlocatie aan en werk de opgeslagen z-waarde bij naar de aangegeven posities. Zoek op het fluorescerende scherm of op een platte camera naar kleine zwarte vlekken of korrels op het raster.

Een goed monster heeft vaak scherpe randen bij hoge vergroting die kristal in volgorde suggereren. Verplaats een geplaatst potentiaalkristal naar het midden van het scherm en verhoog de vergroting zodanig dat de TEM in de hoge vergrotingsmodus komt. Plaats een diafragma met een geselecteerd gebied en wijzig het diafragma in een groter of kleiner formaat om ervoor te zorgen dat het geselecteerde gebied groter is dan het kristal.

Schakel over naar de defractioneringsmodus door op de defractionatieknop op de TEM-handpanelen te drukken om ervoor te zorgen dat het fluorescerende scherm wordt geplaatst. Pas de lengte van de camera aan met de vergrotingsknop, zodat de rand ten minste één resolutie heeft. Pas de diffractiefocus zo aan dat de centrale spot zo scherp en klein mogelijk is.

Verplaats met behulp van de diffractie-pookknoppen de middenbundel naar het midden van het fluorescerende scherm. Plaats de balkstop en zorg ervoor dat de balk erachter zit. Til het fluorescerende scherm op en maak een korte belichting op de camera.

Inspecteer het bijbehorende defractioneringspatroon en zorg ervoor dat het patroon scherpe vlekken heeft die regelmatig in kolommen en rijen zijn gerangschikt. Sla de kristalcoördinaten op in de TEM-gebruikersinterface of door ze op te schrijven en herhaal vervolgens diffractiescreening voor alle potentiële kristallen van belang op het huidige rastervierkant. Centreer het gescreende kristal met een vergroting groter dan 1000x en pas de centrale hoogte van het kristal aan met behulp van een automatische routine of met de hand.

Voeg de geselecteerde diafragma in die het beste past bij de kristalgrootte en -vorm. Kantel het werkgebied in de negatieve en positieve richting totdat de afbeelding wordt afgesloten door de rasterbalken. En let op deze hoeken voor gegevensverzamelingsdoeleinden door de gegevens elke seconde uit te lezen op een moderne camera met een uitleesmodus voor rolluik.

Stel de rotatiesnelheid in door het percentage van de maximale kantelsnelheid op te geven en wanneer te stoppen in de gebruikersinterface van de microscoop of speciale software. Sla de gegevens op in verschillende indelingen, zegt afzonderlijke frames of als een stapel afbeeldingen. Een defractionatiefilm in kristallografisch formaat verzameld uit microkristallen toont een microED-dataset met continue rotatie van een carbamazepine-microkristal geïdentificeerd op een TEM-raster.

Na het verzamelen, integreren en structureren van gegevens wordt een structuur met hoge resolutie bepaald en hangt de duidelijkheid ervan af van de kwaliteit en volledigheid van de gegevens. Het toepassen van het voorbeeld op het raster is van cruciaal belang voor het verkrijgen van goede gegevens. Volgens deze methode kunnen de gegevens verder worden verwerkt met behulp van standaard kristallografische software.

Door aan te tonen dat MicroED een krachtige methode is voor kleine moleculen, is het gebruik ervan wereldwijd geopend voor het oplossen van nieuwe structuren van kritisch belangrijke moleculen.