Name: Microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Leer microkristal elektronendiffractie voor structurele biologie met nanokristallen van kleine moleculen. Deze methode maakt snelle atomaire resolutie mogelijk voor farmaceutische verbindingen zoals carbamazepine.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het Gonen-lab wordt ondersteund door fondsen van het Howard Hughes Medical Institute. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health P41GM136508.

1. Monsternemingen van kleine moleculen voorbereiden
<ol><li>Breng een kleine hoeveelheid (0,01 - 1 mg) poeder, vloeistof of vaste stoffen over in een kleine injectieflacon of buis.</li>
	<li>Voor monsters die al in poedervorm zijn, sluit u de buis af met de dop totdat het monster nodig is. Droog de vloeistofmonsters in poeders voordat u methode 1 (stap 3) of 2 (stap 4) probeert uit te voeren. OPMERKING: Monsters opgelost in vloeistof kunnen methode 3 (5.X) hieronder gebruiken</li>
</ol>2. TEM-roosters voorbereiden
OPMERKING: Sommige TEM's met autoloader-systemen vereisen dat de rasters worden geknipt en in een cassette worden geplaatst voordat ze in de TEM-kolom worden geladen. Clipping omvat het fysiek vastzetten van het 3 mm TEM-raster in een metalen ring die de autoloader kan manipuleren. Deze stap en de volgende stappen kunnen worden uitgevoerd met behulp van normale TEM-rasters of TEM-rasters die zijn geknipt. Voor deze experimenten is het vaak gemakkelijker om de rasters te manipuleren als ze van tevoren zijn geknipt.
<ol><li>Wikkel plastic folie rond het ene uiteinde van een glazen afdekplaat.</li>
	<li>Plaats de TEM-roosters op de folie aan de bovenkant van de afdekplaat met de carbonzijde naar boven gericht. Identificeer de twee zijden van het raster onder een lampje. De koperen kant glanst en lijkt metaalachtig, terwijl de koolstofzijde een grauwe, bruine kleur lijkt (figuur 1C, D). Voor geknipte rasters moet de koolstofzijde naar het platte vlak van de clipring zijn gericht.</li>
	<li>Plaats de schuif met roosters in de gloeiontladingskamer. Gloed ontlaadt de afdekzijde gedurende ongeveer 30 s met behulp van de negatieve instelling op 15 pA. Bewaar de roosters op de afdekplaat in een glazen petrischaal bekleed met filterpapier voordat u het monster aan de roosters toevoegt.</li>
</ol>3. Aanbrengen van het monster op roosters door een homogeen fijn poeder te creëren (methode 1)
<ol><li>Verwijder met een pincet een met gloeiend ontladen TEM-rooster uit de afgedekte petrischaal. Plaats het rooster op een cirkelvormig filterpapier met de koolstofzijde naar boven gericht.</li>
	<li>Verwijder met een kleine spatel een heel klein schepje poeder (ongeveer 0,1 mg) en plaats het op een kleine, vierkante, glazen dekplaat net naast het TEM-rooster op het filterpapier. Plaats nog een kleine vierkante glasplaat of coverslip bovenop het poeder.</li>
	<li>Wrijf met de vingers zachtjes over de twee glasglaasjes om een fijn poeder te maken.</li>
	<li>Hoek de coverslips en plaats ze net boven het TEM-raster op het filterpapier en blijf de coverslips tegen elkaar wrijven, slechts een paar cm boven het gloeiend ontladen TEM-raster (figuur 1).</li>
	<li>Observeer om te zien of het poeder naar het rooster valt. Ontdek het fijngemalen poeder door een van de twee glazen afdekplaten te verwijderen. Borstel het fijne poeder voorzichtig van de dekplaat met een stuk filtreerpapier op het TEM-rooster (figuur 1).</li>
</ol>4. Monster op roosters aanbrengen door de methode "schudden" toe te passen (methode 2)
<ol><li>Pak een rooster met een pincet en laat het in de injectieflacon of tube poedermonster vallen. Sluit de injectieflacon met behulp van de plastic dop om ervoor te zorgen dat er geen materiaal ontsnapt wanneer het wordt geschud.</li>
	<li>Pak de injectieflacon in de hand en schud de injectieflacon zodanig dat het poeder en het rooster beide ongeveer 10 - 30 s bewegen.</li>
	<li>Leeg de inhoud van de injectieflacon op een cirkelvormig filtreerpapier. Pak het raster op een rand en tik voorzichtig op de rasterrand op het filterpapier om overtollig materiaal van het rooster te verwijderen. OPMERKING: Afhankelijk van het type injectieflacon en de grootte, kan men ook een pincet gebruiken om het TEM-rooster te verwijderen zonder de inhoud te legen.</li>
</ol>5. Aanbrengen van het monster op roosters met behulp van de verdampingsmethode (methode 3)
<ol><li>Plaats een rooster (al dan niet geknipt) op het midden van een cirkelvormig stuk filterpapier met de koolstofzijde naar boven en de koperen kant naar beneden.</li>
	<li>Breng met een gasdichte spuit van 10 μL een kleine druppel (ongeveer 1 - 3 μL) opgeloste verbinding aan op de koolstofzijde van het rooster.</li>
	<li>Verplaats het filtreerpapier voorzichtig met roosters in een vacuüm uitdrogingskamer. Dek de kamer af en zet het vacuüm aan. Laat de roosters maximaal één dag onder vacuüm drogen.</li>
	<li>Schakel het vacuüm uit en laat de kamer 5 minuten ontluchten. Het ontluchten van de kamer voorkomt dat de roosters bewegen of wegvliegen wanneer deze onbedekt is.</li>
</ol>6. Bevriezen en laden van roosters in de TEM
<ol><li>Pak de rand van het TEM-raster vast met een pincet en zorg ervoor dat de uiteinden geen van de rastervierkanten doorboren. Til het rooster 1 - 2 cm boven het filtreerpapier en hoek het rooster op 90° ten opzichte van het papier eronder. Tik zachtjes op het pincet terwijl u het rooster stevig getweezed houdt om los poeder te verwijderen.</li>
	<li>Bevries het rooster door de punt van het pincet met het rooster met de hand rechtstreeks in een container met vloeibare stikstof te bewegen. Deze container is meestal het rasterlaadstation voor de TEM, maar kan elke veilige container zijn, zoals een veilige thermoskan met vloeibare stikstof, die acceptabel is voor overdracht of opslag. Vloeibare stikstof is -196 °C.</li>
	<li>Wacht tot het rooster en het pincet stoppen met koken voordat u verder bewerkt.</li>
	<li>Plaats onder vloeibare stikstof of in stikstofdampen het rooster in de monsterhouder met de koolstofzijde zodanig georiënteerd dat het monster vóór de koolstofsteunfilm door de bundel wordt geraakt.</li>
	<li>Laad de monsterhouder in de TEM en zorg ervoor dat het rooster te allen tijde op vloeibare stikstoftemperatuur wordt gehouden.<ol><li>Voor autoloader-systemen plaatst u de geknipte roosters in een cassette in een vloeistofstikstofgekoelde container. Deze cassette wordt overgebracht in een shuttling-container en stelt de autoloader-robotica in staat om de cassette te accepteren terwijl de samples veilig blijven voor shuttling tussen de autoloader en de kolom.</li>
		<li>Voor TEM-opstellingen met zij-ingang bevestigt u het rooster aan een commerciële TEM-houder met zij-ingang. Deze houders hebben een monstervoorbereidingscontainer die is gevuld met vloeibare stikstof om overdracht van het rooster naar de houder mogelijk te maken zonder het monster te verwarmen. De zij-ingangshouder wordt rechtstreeks in de TEM gestoken met het monster aan het einde vastgezet.</li>
	</ol></li>
</ol>7. MicroED-gegevens verzamelen
<ol><li>Lokaliseren en screenen van nanokristallen<ol><li>Open de TEM-kolomkleppen. Pas de vergroting met behulp van de handpanelen aan op de laagst mogelijke vergroting. Zoek de bundel door de intensiteitsknop op de handpanelen zo aan te passen dat een rond, helder gebied zichtbaar is op het fluorescerende scherm.</li>
		<li>Neem een all-grid atlas met een lage vergroting (50 - 300x) met behulp van de juiste software14,15,16 (figuur 2). Zorg ervoor dat de microscoop goed is uitgelijnd voor beeldvorming met zowel lage als hoge vergroting voordat u MicroED-gegevens met hoge resolutie verzamelt.</li>
		<li>Identificeer rastervierkanten zonder gebroken koolstof en hebben een zichtbaar zwart of donker materiaal / korrels op de film (figuur 2). Navigeer rond het raster, fysiek met behulp van de joystick op de handpanelen of virtueel op de verzamelde Atlas, om te zoeken naar rastervierkanten die niet zijn gebroken en microkristallen bevatten.</li>
		<li>Voeg het midden van elk van deze vierkanten toe aan een lijst met rasterlocaties voor onderzoek. Deze locaties kunnen worden toegevoegd aan een notebook, in de gebruikersinterface van de microscoop of in microscoopautomatiseringssoftware.</li>
		<li>Verhoog de vergroting tot 500-1.300x en pas de eucentrische hoogte op elke opgeslagen rasterlocatie aan en werk de opgeslagen Z-waarde bij naar de posities die zijn aangegeven in 7.1.4.</li>
		<li>Zoek op het fluorescerende scherm of op een snelle camera bij deze hogere vergroting naar kleine zwarte vlekken / korrels op het raster. Een goed monster met vaak scherpe randen bij hoge vergroting, wat een kristallijne volgorde suggereert.</li>
		<li>Verplaats een geplaatst potentiaalkristal naar het midden van het scherm en verhoog de vergroting zodanig dat de TEM in de hoge vergrotingsmodus komt. OPMERKING: Dit wordt op verschillende instrumenten aangeduid als een hoge vergroting, Zoom2 of SA-modus en komt meestal overeen met vergrotingen van 3.000x of hoger.</li>
		<li>Voeg een diafragma van een geselecteerd gebied in. Verander het diafragma in een groter of kleiner formaat om ervoor te zorgen dat het geselecteerde gebied net groter is dan het kristal (figuur 3).</li>
		<li>Schakel over naar de diffractiemodus door op de diffractieknop op de TEM-handpanelen te drukken en ervoor te zorgen dat het fluorescerende scherm is geplaatst. Pas de cameralengte met de vergrotingsknop zodanig aan dat de rand ten minste 1 Å resolutie heeft. OPMERKING: Kalibratie van de diffractielengtes moet worden uitgevoerd door een servicemonteur met behulp van een gouden wafelrooster of een bekend monster voordat microED-experimenten worden geprobeerd.</li>
		<li>Pas de diffractiefocus zo aan dat de centrale spot zo scherp en klein mogelijk is. Verplaats met behulp van de diffractieknoppen de middenbundel naar het midden van het fluorescerende scherm</li>
		<li>Plaats de balkstop en zorg ervoor dat de balk erachter zit. Til het fluorescerende scherm op. Neem een korte (ongeveer 1 s) belichting op de camera (figuur 4).</li>
		<li>Inspecteer het bijbehorende diffractiepatroon. Een goede kandidaat voor het verzamelen van een volledige dataset heeft scherpe plekken die regelmatig in kolommen en rijen zijn gerangschikt, en de diffractie zal zich uitstrekken tot meer dan 2 Å, bij voorkeur ten minste tot 1 Å (figuur 4). Sla de kristalcoördinaten op in de TEM-gebruikersinterface of door ze op te schrijven.</li>
		<li>Herhaal diffractiescreening voor alle potentiële kristallen van belang op het huidige rastervierkant.</li>
	</ol></li>
	<li>Dataverzameling<ol><li>Centreer een gescreend kristal op het scherm met een hoge vergroting (> 1.000x). Pas de eucentrische hoogte van het kristal aan met behulp van een automatische routine of met de hand.</li>
		<li>Plaats de geselecteerde gebiedsopening die het beste past bij de kristalgrootte en -vorm zoals bepaald in 7.1.8 (figuur 3). Kantel het werkgebied in de negatieve en positieve richting totdat de afbeelding wordt afgesloten door de rasterbalken (afbeelding 3). Let op deze invalshoeken voor het verzamelen van gegevens.</li>
		<li>Bepaal het aantal frames dat nodig is om de totale hoekwig van de gegevensset te overspannen. Het is typisch om 0,5 - 1,0 ° wiggen te gebruiken voor elk frame, waarbij frames om de 1 tot 5s worden uitgelezen, afhankelijk van de gevoeligheid van de camera. Bijvoorbeeld, een wig van -30° tot +30°, draaiend met een constante snelheid van 1° s-1 met een frame dat om de 1s wordt uitgelezen, zou in totaal 60 frames vereisen.</li>
		<li>Rekening houdend met het maximale totale kantelbereik van -72 ° tot +72 °, begint u het podium te draaien met een constante snelheid van 1 ° s-1 en begint u vervolgens elke 1s de gegevens uit te lezen op een moderne camera met een uitleesmodus voor rolluik (film 1). Dit proces kan handmatig worden uitgevoerd of met behulp van TEM-specifieke software.<ol><li>Stel de rotatiesnelheid in door het % van de maximale kantelsnelheid op te geven en wanneer te stoppen in de gebruikersinterface van de microscoop of speciale software. In dit onderzoek werd gemeten dat dit 0,3° s-1 was voor elk % van de maximale snelheid, maar voor elke microscoop moet onafhankelijk worden geverifieerd. OPMERKING: De verzameling van kantel- en cameragegevens wordt hier onafhankelijk ingesteld, maarsoftwareprogramma's 14 kunnen dit coördineren om het proces te vereenvoudigen.</li>
			<li>Gooi ongeveer 1° aan elke kant van de opgegeven wig in de meeste gevallen weg als dode tijd, waarbij het podium oploopt of vertraagt tot de gewenste rotatiesnelheid.</li>
		</ol></li>
		<li>Sla gegevens in verschillende indelingen op als afzonderlijke frames of als een stapel afbeeldingen (film 1).</li>
		<li>Converteer deze diffractieframes naar een typisch kristallografisch formaat met behulp van MicroED-tools - hier beschikbaar (https://cryoem.ucla.edu). Diffractiebeelden die zijn opgeslagen in SMV-formaat kunnen gemakkelijk worden verwerkt met behulp van gedocumenteerde kristallografische software17,18.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345(2013).</li>
<li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li>
<li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li>
<li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+data+collection+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+A+Foundations+and+Advances%22%5BJournal%5D)">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+limitations+of+neutrons%2C+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li>
<li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109(2020).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li>
<li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li>
<li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li>
<li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-%C3%A5ngstr%C3%B6m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li>
<li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li>
<li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+data+collection+with+SerialEM%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS%3A+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li>
<li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li>
<li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+catalase+determined+by+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600(2014).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Monstervoorbereiding is meestal een iteratief proces, waarbij optimalisaties worden gemaakt na sessies van screening en gegevensverzameling. Voor monsters met kleine moleculen is het vaak verstandig om eerst te proberen het raster te bereiden zonder de roosters te ontladen, omdat veel geneesmiddelen de neiging hebben hydrofoobte zijn 10,11. Als de roosters te weinig nanokristallijne afzettingen hebben, is het een goed idee om het opnieuw te proberen nadat de roos...

Microcrystal electron diffraction (MicroED) is een elektron cryo-microscopie (cryo-EM) methode voor het bepalen van atomaire resolutie structuren van sub-micrometer grootte kristallen 1,2. Kristallen worden aangebracht op standaard transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) -roosters en bevroren door zich in vloeibaar ethaan of vloeibare stikstof te storten. Roosters worden vervolgens geladen in een TEM die werkt bij cryogene temperaturen. Kristallen bevinden zich op het rooster en worden gescreend op initiële diffractiekwaliteit. MicroED-gegevens met continue rotatie worden verzameld uit een subset van de gescreende kristallen, waarbij de gegevens met een snelle camera worden opgeslagen als een film3. Deze films worden omgezet naar een standaard kristallografisch formaat en bijna identiek verwerkt als een röntgenkristallografie-experiment4.
MicroED is oorspronkelijk ontwikkeld om eiwitmicrokristallen 1,2 te onderzoeken. Een knelpunt in eiwitkristallografie is het kweken van grote, goed geordende kristallen voor traditionele synchrotron röntgendiffractie-experimenten. Omdat elektronen interageren met materieordes van grootte die sterker zijn dan röntgenstralen, zijn de beperkingen van de kristalgrootte die nodig is om detecteerbare diffractie te produceren aanzienlijk kleiner5. Bovendien is de verhouding tussen elastische en inelastische verstrooiingsgebeurtenissen gunstiger voor elektronen, wat suggereert dat meer bruikbare gegevens kunnen worden verzameld met een kleinere totale blootstelling5. Constante ontwikkelingen hebben het mogelijk gemaakt om MicroED-gegevens te verzamelen van de meest uitdagende microkristallen 6,7,8,9.
Onlangs is aangetoond dat MicroED een krachtig hulpmiddel is voor het bepalen van de structuren van geneesmiddelen met kleine moleculen uit schijnbaar amorfe materialen10,11,12,13. Deze poeders kunnen rechtstreeks uit een fles gekocht reagens, een zuiveringskolom of zelfs uit het verpletteren van een pil tot een fijn poederkomen 10. Deze poeders lijken amorf met het oog, maar kunnen volledig zijn samengesteld uit nanokristallen of slechts sporenhoeveelheden nanokristallijne afzettingen bevatten in een grotere niet-kristallijne, amorfe fractie. Het aanbrengen van het materiaal op het raster is eenvoudig en de volgende stappen van kristalidentificatie, screening en gegevensverzameling kunnen in de nabije toekomst zelfs worden geautomatiseerd14. Terwijl anderen verschillende methoden kunnen gebruiken voor monstervoorbereiding en gegevensverzameling, zijn hier de protocollen die zijn ontwikkeld en gebruikt in het Gonen-laboratorium voor het voorbereiden van monsters van kleine moleculen voor MicroED en voor gegevensverzameling gedetailleerd.

<table><tbody><tr><td>0.1-1.5mL Eppendorf tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-282-300</td><td>Elke flacon of buis zal volstaan.</td></tr><tr><td>Autogrid clips</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036173</td><td>Klemmende roosters zijn niet vereist voor MicroED. Ze zijn wel vereist voor Thermo-Fisher TEMs uitgerust met een autoloader-systeem.</td></tr><tr><td>Autogrid C-rings</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazapine</td><td>Sigma</td><td>C4024-1G</td><td>Elke hoeveelheid is voldoende voor deze experimenten</td></tr><tr><td>CMOS based detector</td><td>Thermo-Fisher</td><td>CetaD 16M</td><td>We gebruikten een CetaD 16M, maar elke detector met rolling shutter-modus of voldoende snelle uitlezing is acceptabel.&nbsp;</td></tr><tr><td>Delphi software</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>Software op Thermo-Fisher TEM-systemen die handmatige rotatie van de monsterstadium mogelijk maakt</td></tr><tr><td>EPU-D software</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>Commerciële software voor het verwerven van MicroED-gegevens</td></tr><tr><td>Glass cover slides</td><td>Hampton</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>Glow discharger</td><td>Pelco</td><td>easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>High PrecisionTweezers</td><td>EMS</td><td>78325-AC</td><td>Elke hoge precisie pincet zal volstaan</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen vessel</td><td>Spear Lab</td><td>FD-800</td><td>Een standaard schuim vat voor het hanteren van monsters onder vloeibaar stikstof - 800mL</td></tr><tr><td>SerialEM software</td><td>UC Boulder</td><td>N/A</td><td>Gratis software gedistribueerd door D. Mastronarde. Afdeling Moleculaire, Cellulaire en Ontwikkelingsbiologie</td></tr><tr><td>TEM grids</td><td>Quantifoil/EMS</td><td>Q310CMA</td><td>Multi-A 300 mesh roosters werden hier gebruikt, maar elke dunne koolstof roosters zullen werken. Voor deze kleine moleculen raden we aan te beginnen met continue koolstof.&nbsp;</td></tr><tr><td>transmission electron microscope (TEM)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Talos Arctica</td><td></td></tr><tr><td>Whatman circular filter paper</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>90mm of groter</td></tr></tbody></table>

microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van kleine molecuulmonsters voor microkristalelektronendiffractie (MicroED) experimenten wordt beschreven. MicroED is ontwikkeld om structuren van eiwitten en kleine moleculen op te lossen met behulp van standaard elektronen cryo-microscopie (cryo-EM) apparatuur. Op deze manier zijn kleine moleculen, peptiden, oplosbare eiwitten en membraaneiwitten onlangs bepaald tot hoge resoluties. Protocollen worden hier gepresenteerd voor het voorbereiden van rasters van geneesmiddelen met kleine moleculen met behulp van het medicijn carbamazepine als voorbeeld. Protocollen voor het screenen en verzamelen van gegevens worden gepresenteerd. Aanvullende stappen in het totale proces, zoals data-integratie, structuurbepaling en verfijning, worden elders gepresenteerd. De tijd die nodig is om de rasters met kleine moleculen voor te bereiden, wordt geschat op minder dan 30 minuten.

MicroED is een cryoEM-methode die gebruik maakt van de sterke interacties tussen elektronen en materie, waardoor het onderzoek van verdwijnend kleine kristallen12,13 mogelijk is. Na deze stappen wordt verwacht dat het een diffractiefilm in kristallografisch formaat heeft die is verzameld uit microkristallen (film 1). Hier wordt de techniek gedemonstreerd met carbamazepine12. De resultaten tonen een microED-dataset met cont...

Hier beschrijven we de procedures die in ons laboratorium zijn ontwikkeld voor het bereiden van poeders van kleine molecuulkristallen voor microkristalelektronendiffractie (MicroED) -experimenten.

Microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

In deze procedure laten we zien hoe je in enkele minuten van een klein molecuulpoeder naar een driedimensionale structuur kunt gaan. Dit is een transformatieve techniek voor de chemiegemeenschap. Veel verbindingen groeien niet gemakkelijk uit tot grote kristallen.Met MicroED kunnen we atomaire resolutiestructuren bepalen uit kristallen van nanometergrootte. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Mike Martynowycz, die professor is aan de UCLA. Breng om te beginnen een kleine hoeveelheid poeder, vloeistof of vaste stoffen over in een kleine injectieflacon of buis.Voor monsters die al in poedervorm zijn, sluit u de buis af met de dop totdat het monster nodig is. Droog de vloeistofmonsters op dezelfde manier in poeders. Wikkel plastic folie rond het ene uiteinde van een glazen afdekplaat.Plaats de TEM-roosters op de folie bovenop de afdekplaat met de bruine kleur carbon naar boven gericht. Plaats vervolgens de dia met roosters in de gloeiontladingskamer en ontlaad de afdekplaat gedurende ongeveer 30 seconden met behulp van de negatieve instelling op 15 picoampères. Bewaar de roosters op de afdekplaat in een glazen petrischaal bekleed met filterpapier voordat u het monster aan de ro

microcrystal-electron-diffraction-of-small-molecules

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Evaluatie van twee-dimensionale (2D) kristallisatie onderzoeken voor de vorming van de bestelde membraaneiwit arrays is een zeer kritische en moeilijke taak in elektron kristallografie. Hier beschrijven we onze aanpak in het screenen en identificeren van 2D-kristallen van overwegend kleine membraaneiwitten in de range van 15 - 90kDa.

Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie

Dit artikel geeft een gedetailleerde werkwijze om de microstructuur van ultrafijne korrel en nanokristallijne materialen met een scanning elektronenmicroscoop uitgerust met een standaard elektronen backscatter diffractie systeem karakteriseren. Metaallegeringen en mineralen presenteren verfijnde microstructuren worden geanalyseerd met deze techniek, die de diversiteit van de toepassingsmogelijkheden.

Karakterisering van Ultra-fijnkorrelige en nanokristallijne materialen met behulp van Transmission Kikuchi Diffraction

Een protocol wordt gepresenteerd voor röntgenkristallografie onder toepassing van eiwitmicrokristallen. Twee voorbeelden die in vivo- gegroeide microkristallen analyseren na zuivering of in cellulose worden vergeleken.

Microkristallografie van eiwitkristallen en<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffractie

Een gestroomlijnde protocol voor het uitvoeren van een uitgebreide biochemische en structurele karakterisering van een koolhydraat-substraat bindend-proteïne van Streptococcus pneumoniae is gepresenteerd.

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

We beschrijven een experiment dat is ontworpen om de elektronische schade veroorzaakte in nanokristallen van Buckminsterfullerene (C-60) sonde door intens, femtoseconde pulsen van x-stralen. Het experiment vond dat verrassend, in plaats van stochastische, de X-ray elektron dynamiek in C60 zijn sterk gecorreleerd geïnduceerde, ruimtelijk honderden eenheid cellen binnen de kristallen1.

Metingen van luchtverontreiniging over lange afstand elektronische correlaties tijdens femtoseconde diffractie experimenten uitgevoerd op nanokristallen van Buckminsterfullerene

Dit protocol beschrijft in detail hoe te fabriceren en te exploiteren van microfluidic apparaten voor röntgendiffractie gegevensverzameling bij kamertemperatuur. Bovendien, het beschrijft hoe eiwitten kristallisatie controleren door Dynamische lichtverstrooiing en hoe om te verwerken en analyseren diffractie gegevens verkregen.

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

We beschrijven de instelling van een beamline bedoeld voor het uitvoeren van snelle twee-dimensionale röntgenfoto fluorescentie en x-ray microdiffraction toewijzing van kristallen of poeder monsters met Laue (polychromatische straling) of poeder (monochromatische straling) diffractie. De resulterende kaarten geven informatie over stam, oriëntatie, fase distributie en plastische vervorming.

Synchrotron X-ray Microdiffraction en fluorescentie beeldvorming van minerale en Rock monsters

Hier gepresenteerd is een protocol voor het labelen van membraaneiwitten in zoogdiercellen en het monster bedekt met grafeen voor vloeibare-fase scanning transmission electron microscopie. De stabiliteit van de monsters tegen de schade veroorzaakt door straling kan ook bestudeerd met dit protocol.

Grafeen behuizing van chemisch vaste zoogdiercellen voor vloeibare fase elektronenmicroscopie

We bieden een algemeen overzicht van kwantitatieve microanalysemethoden voor het schatten van de locatiebezetting van onzuiverheden en hun chemische toestanden door gebruik te maken van elektronengeangaliseerde verschijnselen onder incidentele elektronenstraal-schommelomstandigheden, die betrouwbaar informatie extraheren uit minderheidssoorten, lichtelementen, zuurstofvacatures en andere punt/lijn/planaire defecten.

Kwantitatieve atomaire-site analyse van functionele dopants/puntdefecten in kristallijne materialen door elektronengeankan-verbeterde microanalyse

Hier presenteren we een protocol voor cryogene monstervoorbereiding en overdracht van kristallen naar het vacuümeindstation op beamline I23 bij Diamond Light Source, voor macromoleculaire röntgenkristallografie-experimenten met lange golflengte.

Monstervoorbereidings- en overdrachtsprotocol voor in-vacuüm kristallografie met lange golflengte op Beamline I23 bij Diamond Light Source

Deze bijdrage beschrijft hoe eiwitkristallisatie op kristal-op-kristalapparaten kan worden ingesteld en hoe geautomatiseerde seriële gegevensverzameling bij kamertemperatuur kan worden uitgevoerd met behulp van het on-chip kristallisatieplatform.

On-chip kristallisatie en grootschalige seriële diffractie bij kamertemperatuur

Leer microkristal elektronendiffractie voor structurele biologie met nanokristallen van kleine moleculen. Deze methode maakt snelle atomaire resolutie mogelijk voor farmaceutische verbindingen zoals carbamazepine.

Microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen

Meer video's verkennen