Temperatuurgecontroleerde montage en karakterisering van een druppelinterface-bilayer

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om nauwkeurig een druppelinterface tweelaags, of DIB, modelmembraan te verwarmen, waardoor een verscheidenheid aan temperatuurgerelateerde effecten die optreden in cellulaire omgevingen kan worden bestudeerd. Het kernvoordeel komt voort uit de mogelijkheid om de badtemperatuur in een reservoir met een laag volume lokaal te meten en te regelen zonder de toegang voor de elektrische of optische kenmerken van de DIB te belemmeren. Het vermogen om het vloeistofbad nauwkeurig te verwarmen, ontgrendelt de mogelijkheid om de transport- en signaleringseigenschappen in DBI's te bestuderen die zijn gevormd uit een veel grotere verscheidenheid aan membraanbestanddelen, waaronder natuurlijke cellulaire extracten.

Dit is een meerstappenprotocol waarbij gebruik wordt gemaakt van meerdere apparatuur die op de voet moet worden gevolgd om voldoende experimentele nauwkeurigheid te bereiken, zodat elke ambiguïteit in het geschreven proces kan worden verduidelijkt via visuele demonstratie. Om te beginnen verzamelen twee stukken van een millimeter dik isolerend rubber bijgesneden tot 25 bij 40 millimeter lang, twee stukken van een zes millimeter dik rubber die ook 25 bij 40 millimeter zijn, een voorbereide aluminium basisarmatuurassemblage en een acryloliereservoir dat past in het kijkvenster van de aluminium basisarmatuur. Plaats de dunnere rubberen stukken op het podium van de microscoop zodat de lange rand van elk stuk raaklijnig is aan de podiumopening.

Plaats de aluminium basisarmatuur bovenop de isolerende pads met het kijkvenster van het armatuur gecentreerd boven de objectieve lens. Plaats een dikker stuk rubber bovenop elk weerstandsverwarmingselement en gebruik vervolgens een microscooptrapclip om het op zijn plaats te houden om de verwarmingselementen te beschermen tegen schade veroorzaakt door de podiumclips en om te isoleren tegen onbedoelde elektrische kortsluiting. Buig voorzichtig het meetuiteinde van een thermokoppel om een hoek van 90 graden te bereiken op ongeveer vier millimeter van het einde.

Steek de gebogen punt van het thermokoppel in de linkerbenedenhoek van het aluminium armatuur en zet het voorzichtig vast met een borgschroef. Plaats het acrylreservoir in de put van het aluminium armatuur voordat u hexaderietolie aan de put van het aluminium armatuur toevoegt om het risico op het opvangen van luchtbellen tussen het kijkvenster en de bodem van het acrylreservoir te minimaliseren. Doseer ongeveer 1.000 microliter hexadecane-olie in de put van het aluminium armatuur om een maximaal oppervlak te bieden voor warmteoverdracht, zonder dat olie over de randen van het armatuur op het microscoopstadium of de objectieve lens kan morsen.

Giet ongeveer 1.000 microliter hexaderietolie in het acrylreservoir zonder het te vullen. Meet de nominale capaciteit van het membraan terwijl de temperatuur van het oliebad wordt verlaagd vanaf een vast punt dat bilaagvorming mogelijk maakt om thermotrope faseovergangen van de lipiden in het membraan te identificeren. Klik met de rechtermuisknop op de temperatuurgrafiek op de GUI en wis de weergavegegevens om ervoor te zorgen dat er voldoende ruimte in de buffer beschikbaar is voor volgende opnamen.

Breng met behulp van de golfvormgenerator die is aangesloten op de patchklemversterker een driehoekige spanningsgolfvorm aan over de druppelinterface-bilayer, of DIB, elektroden en registreer de geïnduceerde stroomrespons via de bilayer. Koel de bilayer af door de insteltemperatuur in stappen van vijf graden te verlagen en wacht minimaal vijf minuten op de nieuwe steady-state temperatuur tussen temperatuurveranderingen totdat de gewenste temperatuur is bereikt. Nadat het oliebad en het koelen van de tweelaagse tot de gewenste minimumtemperatuur, klikt u met de rechtermuisknop nogmaals op de temperatuurgrafiek in de GUI en exporteert u de temperatuurgegevens versus tijd naar een spreadsheetsoftware.

Stop de huidige opname. Bereken op de gemeten stroom de nominale capaciteit van de nominale golfstroomrespons versus de tijd tijdens de afkoelperiode. Zet de nominale capaciteit versus temperatuur in kaart om te observeren hoe de membraancapacitantie veranderde en lokaliseer vervolgens niet-monotone veranderingen in capaciteit versus temperatuur om de smelttemperatuur te identificeren.

Beoordeel ook de quasi statisch-specifieke capaciteit van de bilayer bij vaste temperaturen door achtereenvolgens de temperatuur van het oliebad en het bilayer-gebied te verhogen. Wijzig de instelpunttemperatuur in stappen van 10 graden Celsius met behulp van de GUI en laat het systeem gelijk zijn aan de nieuwe temperatuur. Voer eerder beschreven stappen uit om de meting van capacitieve stroom en opname te starten.

Verander het bilayer-gebied door de posities van de elektroden zorgvuldig aan te passen met behulp van de micromanipulatoren. Zorg ervoor dat de vierkante golfstroom een steady state amplitude bereikt en verzamel beelden van de DIB om berekening van membraangebied versus tijd mogelijk te maken. Gebruik een camera die op de microscoop is gemonteerd om de tweelaagse afbeelding te maken, gezien vanaf het diafragma.

Voeg tegelijkertijd een digitale tag toe aan de huidige opnamesoftware om het bijbehorende tijdspunt voor het verzamelen van afbeeldingen te markeren. Verkrijg in totaal vijf DIB-beelden en steady-state regio's van tweelaagse stroom, reset vervolgens de temperatuur en herhaal de beeldvorming. Analyseer de huidige opnamen en DIB-beelden op de gelabelde tijdspunten die overeenkomen met steady state bilayer-gebieden, extraheer de capaciteit van de tweelaagse en het gebied voor elke temperatuur.

Plot capaciteit versus gebied voor elke temperatuur en bereken de helling van de eerste orde regressie, die de specifieke capaciteit van de bilayer bij elke temperatuur vertegenwoordigt. Plot vervolgens waarden van specifieke capaciteit versus hun respectieve temperaturen. Onderzoek de specifieke capaciteits- versus temperatuurgegevens op niet-monotone variaties om smelttemperaturen te identificeren.

Beoordeel de dynamiek van spanningsafhankelijke ionenkanaalvorming door een dc-spanningsstapingang over de tweelaagse te genereren. Stel de beginspanning in millivolt in op de gewenste stapwaarde en de eindspanning en stapgrootte op een waarde die hoger is dan de gewenste stap. Stel een gewenste duurtijd in voor de stapinvoer in seconden en kies vervolgens de gewenste polariteit voor de stapinvoer.

Schakel de patchklemversterker om de commandospanning afkomstig van de laboratoriumweergave of spanningsuitgangsmodule naar het hoofdstadium te sturen, zet de spanning aan en registreer de geïnduceerde stroomrespons, die een S-vormige reactie op een kritische spanning zou moeten remmen. Verkrijg afzonderlijk dynamische stroomspanningsrelaties voor een membraan bij de gewenste temperaturen om spanningsafhankelijke relaties zoals ionenkanaalgedrag te onthullen. Schakel de patchklemversterker om de commandospanning afkomstig van de golfvormgenerator naar het hoofdstadium te sturen en stroomopnamen te starten.

Op de golfvormgenerator voert u een continue sinusoïdale golfvorm uit met een gewenste amplitude, offset en frequentie. Registreer de geïnduceerde stroomrespons over een of meerdere cycli en herhaal naar wens voor verschillende sinusamplitudes, frequenties en temperaturen. Het temperatuurcontrolesysteem werd gebruikt om de temperatuurafhankelijkheid van een DIB gevormd uit hersentotaal lipidenextract, of BTLE, lipiden te laten zien.

Metingen van capacitieve stroom en temperatuur versus tijd worden getoond tijdens een verwarmingscyclus van kamertemperatuur tot ongeveer 60 graden Celsius. Veranderingen in nominale capaciteit versus temperatuur over één volledige koel-/verwarmingscyclus, na de eerste tweelaagse vorming bij 60 graden Celsius, werden gedocumenteerd. Quasistatische metingen van specifieke capaciteit bij verschillende temperaturen kunnen worden gebruikt om de lipidensmeltende temperatuur te identificeren.

Het plotten van de capaciteit van een bilaag versus tweelaags gebied maakt een lineaire regressie mogelijk, waarbij de helling de waarde van specifieke capaciteit vertegenwoordigt. Het DIB-beeld laat zien dat, wanneer de temperatuur onder de smelttemperatuur ligt, het membraan een zeer zelfklevende toestand aanneemt, zelfs onder spanning van uitgerekt druppels veroorzaakt door goed gescheiden elektroden. De getoonde stroom versus spanningssporen werden verkregen door sinusvormige membraanspanningen toe te passen en de geïnduceerde stroom bij twee verschillende temperaturen te meten.

De pijlen en daaropvolgende getallen helpen bij het visualiseren van de opeenvolgende kwartalen van de sinusvormige spanning met betrekking tot de tijd. De gemeten stroomdichtheid voor een monazomycine-gedopt BTLE-membraan op hetzelfde spanningsniveau en twee verschillende temperaturen wordt hier weergegeven. Het is cruciaal om de hexadecane olie correct in de put van de aluminium armatuur te gieten.

Als dit niet of niet zorgvuldig gebeurt, zullen zich luchtbellen onder de acrylput vormen, die het bottom-up zicht van de DIB zullen belemmeren. De gebruiker moet ook onthouden om de gegevensbuffer in de temperatuurregelingssoftware vóór elke meting te wissen om volledige registratie te garanderen. Deze procedure maakt het mogelijk om biomimetische membranen te karakteriseren over een reeks temperaturen, wat nodig is om temperatuurafhankelijkheid van membraanstructuur en transport te bestuderen.

Bovendien zou deze mogelijkheid kunnen worden gebruikt om nanoschaaleffecten van andere membraanactieve soorten, zoals biologische ionenkanalen en gemanipuleerde nanomaterialen, aan het licht te brengen.