Multifunctionele, Micropipet-gebaseerde methode voor opname en het stimuleren van bacteriële mechanosensitieve Ion Channels in Droplet Interface dubbellagen

Het algemene doel van deze procedure is om mezcalkanalen functioneel te reconstrueren in een druppelinterface, bilaagsysteem, en om de respons van deze mechano-gevoelige kanalen op harmonische mechanische stimuli te onderzoeken. Deze methode maakt de studie van de mechano-elektrische activiteit van de V 23 T mescal-mutant mogelijk in reactie op harmonische mechanische excitatie na reconstititutie in een druppelinterface-bilaagsysteem. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze de technische voordelen van zowel de patch clamp-techniek als de druppelinterface-bilaagmethoden benut met de mogelijkheid tot miniaturisatie en de mogelijkheid om de chemische samenstelling van elke kant van het membraan te beheersen.

Om liposomen te formuleren, bereid 10 milliliter van een twee milligram per milliliter lipideoplossing voor door 10 milliliter kaliumchloridebuffer toe te voegen aan 20 milligram D-P-H-P-C synthetische lipiden, verkregen als gelyofiliseerd poeder. Zorg ervoor dat zowel lipidedragers als bufferoplossing grondig worden gemengd. De mix moet er homogeen en wazig uitzien wanneer alles is opgelost.

Vries de mix nu in bij min 20 graden Celsius, ontdooi vervolgens de nieuwe lipidemix volledig, laat de mix ontdooien op kamertemperatuur en niet in een verwarmde omgeving. Gebruik na een totaal van zes vries-ontdooicycli een commercieel verkrijgbare extruder om de lipiden te extruderen door de hele lipidesuspensie eerst door een 0,4 micron polycarbonaatmembraanfilter te forceren en vervolgens zes keer door een 0,1 micron membraanfilter. Dit proces levert deeltjes op met diameters van ongeveer 100 nanometer.

Om het olie reservoir te fabriceren, boor twee tegenover elkaar liggende gaten door de wand van een acrylcilinder met een diameter van twee inch en een lengte van 1,5 centimeter. De gaten moeten een millimeter in diameter zijn en een centimeter van de bodem. Boor vervolgens twee vier millimeter gaten concentrisch op de eerder geboord millimetergaten.

De diepten van de gaten moeten elk een millimeter zijn. Zorg ervoor dat u ze niet helemaal doorboort. Deze gaten zijn gemaakt om de rubberen pakkingen te passen.

Plaats en lijm twee rubberen pakkingen met een binnendiameter van één millimeter in de grotere gaten om te voorkomen dat olie lekt. Lijm vervolgens de machine naar de cilinder op een 10 centimeter bij 10 centimeter dunne acrylplaat met behulp van een multifunctionele epoxy op de dag van het experiment, snijdt een zeven centimeter lengte van 2 250 micron diameter zilverdraad, en dompel vervolgens de punten gedurende twee uur in bleekmiddel. Om een ​​zilverchloridecoating te vormen, geeft een grijze kleur aan dat een zilverchloridecoating is gevormd.

Splits een 10 centimeter lang boorsilicaat glas capillair met een buitendiameter van een millimeter en een binnendiameter van 0,58 millimeter in twee vijf centimeter capillairen met behulp van een glasnijder. Vul de capillairen met de P-E-G-D-M-A hydrogel met behulp van een schuine naald met een diameter van 18 gauge om te voorkomen dat de gehydrateerde hydrogel uit de capillairen opzwelt. Houd een afstand van drie millimeter bij de uiteinden en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de capillairen zijn.

Plaats de zilveren, zilverchloride elektroden in de met hydrogel gevulde capillairen. Genees de P-E-G-D-M-A hydrogel door middel van vrije radicale fotopolymerisatie bij blootstelling aan ultraviolet licht gedurende twee minuten bij één watt met behulp van een ultraviolette spot. Het experiment is opgesteld onder een Faraday-kooi die is geaard op een aardverbinding op de patch versterker. Bevestig een van de micropipetten aan een rechte micro-elektrodehouder met een mannelijke connector.

Verbind vervolgens de micro-elektrodehouder met de hoofdfase van de patch versterker. Om de hoofdfase met de grond te verbinden, soldeer een geïsoleerde koperen draad met een diameter van 18 gauge aan een geschikte connector voor de hoofdfase montage op een drie-assige handmatige micro manipulator door eerst de hoofdfase montageplaat aan de micro manipulator te bevestigen en vervolgens de hoofdfase aan de montageplaat te bevestigen. Bevestig met behulp van de juiste schroeven de tweede micropipet aan de lineaire actuator via een lab gemaakte connector en monteer vervolgens beide op een tweede micro manipulator.

De micropipetten moeten tegenover elkaar worden uitgelijnd en horizontaal worden uitgelijnd. Meng vervolgens in een glazen potje 0,1 milliliter van de D-P-H-P-C liposomen met 0,01 milliliter van de V 23 T mescal protea liposomenoplossing. Vul met behulp van een 34 gauge microvulnaald de uiteinden van beide micropipetten met een proteosomeoplossing.

Plaats het reservoir bovenop een rechtopstaande microscoop en leid de micropipetten door de tegenover elkaar liggende millimetergaten. Vul vervolgens het reservoir tot aan het oppervlak met hexadecaange om de sferische druppels aan de punt van de micropipetten te vormen. Gebruik een derde bosilicaat glas micropipet met een diameter van 10 micron, gemonteerd op een derde micro manipulator, om verdunde V 23 T mescal protea liposomenoplossing af te geven bij de uiteinden van de micropipetten en om de druppels te vormen.

Beheers de grootte van de druppels door het volume te verminderen of te verhogen zoals gewenst, en laat ze 10 minuten rusten om de monolagen volledig te laten vormen. Breng vervolgens de druppels in contact door lagen. De vorming zal binnen één tot twee minuten plaatsvinden.

Na het instellen van de software en apparatuur zoals beschreven in het tekstprotocol, gebruikt u een BNC-kabel om de uitgang van een golfvormgenerator aan te sluiten op de externe opdrachtinvoer voorschakelaar. Stuur een 10 hertz, 500 millivolt piek-tot-piek driehoekige golfvorm naar de hoofdfase. Gebruik de micro manipulator.

Verplaats de glazen micropipetten horizontaal om de druppels in contact te brengen tot ze lichtjes raken en wacht totdat de bilagverdunning optreedt. De voortgang van het bilagvormingsproces kan visueel worden gezien via de microscoop en kan worden gemonitord door middel van stroommeting. Pas de bilaggrootte aan op ongeveer 250 micron in diameter door de positie van de druppel die op de actuator is gemonteerd te regelen met behulp van de manipulator. De bilaggrootte kan visueel worden geschat via de microscoop.

Zodra de bilag is gevormd en stabiel is, stimuleer de dru