Lipide dubbelgelaagde experimenten met Contact Bubble Bilayers voor Patch-Clampers
16 januari 2019
Hier presenteren we een protocol voor de vorming van lipide-bilayers met behulp van een contact zeepbel dubbelgelaagde methode. Een water-zeepbel is geblazen in een organisch oplosmiddel, waarbij een monolayer wordt gevormd op het grensvlak water / olie. Twee pipetten zijn gemanipuleerd om het dok van de belletjes vormen een dubbelgelaagde.
De Contact Bubble Bilayer methode is een alternatieve techniek voor conventionele Lipid Bilayers. en deze methode maakt meer veelzijdige trillingen door het membraan mogelijk. De CBB methode integreert de voordelen van Planar Lipid Bilayer en patch clamp methode.
Als lipidebilayertechniek kan een CBB met een willekeurige lipidesamenstelling worden gevormd. We hebben een CBB ontwikkeld voor single channel stroomopnames met een hoge signaal-ruisverhouding. Deze methode maakt variëteiten van membraan trillingen en biedt een enorm type platform aan de kanaalmembraan interface.
Iedereen heeft ervaren blazen een zeepbel. De gelijkaardige manoeuvres worden genomen voor de vorming CBB door de toegepaste druk eerder dan het blazen door mond manueel te verfijnen. Oefen en geniet van de CBB.
Om deze procedure verspreiden fosfolipiden in chloroform bij een gewenste concentratie in een ronde bodemkolf. Plaats de fosfolipidenoplossing op een roterende verdamper die is aangesloten op een stikstofgascilinder. Draai de kolf onder stikstofstroom bij kamertemperatuur tot er een dunne fosfolipidefilm verschijnt.
Plaats vervolgens de open kolf in een desiccator die is aangesloten op een vacuümpomp. Met behulp van de vacuümpomp de binnenkant van de desiccator gedurende enkele uren aanzuigen om de chloroform grondig te verwijderen. Voeg vervolgens een passend volume elektrolytoplossing toe aan de kolf en hang de fosfolipiden op om een twee milligrma per milliliter fosfolipidensuspensie te verkrijgen.
Sonciate de schorsing voor 20 tot 30 seconden met behulp van een bad sonicator om een meerlaagse vesicle schorsing te verkrijgen. Voor de bereiding van proteoliposomen die ionenkanaaleiwitten bevatten, voegt u een eiwitoplossing toe aan de meerlaagse vesicle suspensie. En sonicate voor enkele seconden met behulp van het bad sonicator.
Om grote boring glazen pipetten voor te bereiden, plaatst u een glazen capillair in een pipettrekker en fabriceert u de micropipet met een fijne taps toelopende punt door middel van twee stappen trekken. Zet vervolgens de micropipet op een microsmederij en neem contact op met de punt van de micropipet op een platina filament op het taps toelopende gedeelte met een diameter van 30 tot 50 micrometer. Verwarm de gloeidraad kort en zet hem onmiddellijk uit.
Met behulp van gedestilleerd water en ethanol schoon het oppervlak van het glas glijbaan met een ondiepe put. Breng vervolgens het siliconen reagens aan op de glasplaat en laat het reagens volledig in de lucht drogen. Plaats vervolgens de glazen schuif op het podium van een omgekeerde microscoop.
Voeg 100 microliter hexadecane toe in de ondiepe put van de siliconen glazen schuif. Met behulp van een tuberculine spuit vul de elektrolyt oplossing tot de helft van de lengte van de micropipet. Zet vervolgens de micropipet met de drukpoort op de micropipethouder, waardoor de zilver/zilverchloridedraadelektrode in de pipetelelektrolytoplossing kan weken.
Sluit een van de micropipette houders aan op het hoofdstadium van een patchklemversterker en de andere met de elektrische grond. Sluit vervolgens een microinjector aan op de drukpoort van de micropipethouder. Pas de micropipet aan op een geschikte positie boven het stadium van een omgekeerde microscoop met behulp van de micromanipulator.
Om het elektrodeverschuivingspotentieel aan te passen, plaatst u een microliter van dezelfde elektrolytoplossing die wordt gebruikt om de micropipet op het vlakke oppervlak rond de ondiepe put van de glazen glijbaan te vullen om een elektrolytkoepel te creëren. Week de punt van beide micropipetten in de elektrolytkoepel. Pas daarna het elektrodeverschuivingspotentieel van de patchklemversterker aan.
Om de liposoom oplossing van de tip te trekken, voeg een microliter liposoom oplossing op het vlakke oppervlak rond de ondiepe put van het diaglas. Plaats vervolgens het puntje van de micropipet in het liposoom met koepel. Aspirate de liposoom bevattende oplossing met behulp van de microinjector.
Herhaal de procedure voor de andere mircopipette voor aspirating kanaal gereconstitueerde liposomen. Plaats nu de micropipet in de hexadecane in de ondiepe put. Blaas een waterbel langzaam door het verhogen van de druk tot de bel bereikt de gewenste grootte en behoud dezelfde druk daarna.
Gooi de bel door het passeren van de tip door de olie-air interface als het moeilijk is om de grootte van de zeepbel stabiel te houden. Herhaal de procedures totdat twee stabiele bellen worden gevormd. Stel een contact tussen de twee bubbels.
Stem de druk af om de belgrootte te behouden, omdat de grootte zelfs bij de constante intrabeldruk geleidelijk kan veranderen. Stel het membraanpotentieel in op de juiste waarde met behulp van de patchclaimversterker en wacht tot de kanaalstroom naar voren komt. Voor stabiele lipide bilayer vorming is het essentieel om de blotters schoon te maken.
Glascapillaire of pipetpreparaat moet grondig worden gewassen en besmetting door de wasmiddelmoleculen voorkomen. Zodra de CBB had gevormd het kanaal moleculen, hetzij in waterige oplossing of in het liposoom werden spontaan ingevoegd in de bilayer binnen de spanwijdte van een paar tot tientallen minuten. Het inbrengen van de kanalen werd bevestigd door de stapsgewijze toename van de huidige amplitude onder het toegepaste membraanpotentieel.
Een bilayer gevormd door de CBB-methode kan worden uiteengevallen in twee monolagen. De pTB-kanaalstroom kwam onmiddellijk na het bevestigen van de twee monolagen tevoorschijn. En de stroom werd groter als de zijn van contact verhoogd de amplitude van de stroom werd gesynchroniseerd met de detach hechten manipulatie van de CBB.
Als het aantal blow outs van bellen verhoogt de lipide concentratie in de waterige oplossing afneemt en de monolaag niet wordt gevormd. Probeer dan om de druk op liposoom sectie te verlichten. Zodra de CBB formatie en kanaal reconstitutie zijn vastgesteld u proberen om samenstellingen van waterige oplossing en membraan variëren via profusie of het injecteren van een hydrofiele of hydrofobe stoffen.
De CBB-methode heeft veelzijdige manieren geopend om kanaalmembraan samenspel te verkennen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie introduceert de Contact Bubble Bilayer (CBB)-methode voor het vormen van lipide dubbellagen, wat een innovatief alternatief biedt voor conventionele technieken. De methode maakt veelzijdige membraanvibraties en opnames van enkelkanalenstromen met een hoge signaal-ruisverhouding mogelijk, waardoor het onderzoek naar interacties tussen kanalen en membranen wordt verbeterd.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Biofysica
- Elektrofysiologie
- Lipide membraantechnologie
Achtergrond
- Lipidbilayers zijn essentieel voor het bestuderen van membraaneiwitten.
- Conventionele methoden hebben beperkingen op het gebied van flexibiliteit en stabiliteit.
- De CBB-methode combineert de voordelen van planaire lipidbilayers en patchclamp-technieken.
- Deze techniek maakt hoogwaardige opnames van ionkanaalactiviteiten mogelijk.
Doel van de studie
- Om een robuuste methode te ontwikkelen voor de vorming van lipide dubbellagen met behulp van een contactbel-benadering.
- Om enkelkanaalregistraties met een verbeterde kwaliteit mogelijk te maken.
- Om membraandynamiek en kanaal-membraaninteracties te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- De CBB-methode maakt gebruik van gecontroleerde manipulatie van waterbellen in een organisch oplosmiddel om dubbellagen te creëren.
- Fosfolipiden worden geprepareerd en gesoniceerd om meerlaagse vesikels te vormen, gevolgd door de incorporatie van ionkanaaleiwitten.
- Micropipetten worden gefabriceerd voor de precieze applicatie en stabilisatie van bellen tijdens de vorming van de dubbellaag.
- Experimentele opstellingen maken gebruik van patchclamp-versterkers om ionkanaalstromen na de vorming van de dubbellaag te monitoren.
Belangrijkste resultaten
- De CBB-methode ondersteunt effectief de insertie van kanaaleiwitten in dubbellagen, wat wordt bevestigd door veranderingen in de stroomamplitude.
- Er werden stabiele dubbellagen gevormd, wat de mogelijkheid aantoont om enkelkanaalstromen te registreren.
- De methode toonde aan dat aanpassingen in de belgrootte van invloed kunnen zijn op de membraanstabiliteit en de continuïteit van de stroom.
Conclusies
- De CBB-methode vormt een belangrijke vooruitgang in de vorming van lipide dubbellagen, wat veelzijdige toepassingen in elektrofysiologische studies mogelijk maakt.
- Deze innovatieve aanpak vergroot ons begrip van de dynamiek tussen kanalen en membranen.
- De bevindingen onderstrepen het potentieel om lipide dubbellaagtechnologieën aan te passen aan verschillende experimentele condities.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
De Contact Bubble Bilayer (CBB)-methode pakt een cruciale uitdaging in ionkanaalonderzoek aan door opnames met een hoge signaal-ruisverhouding mogelijk te maken, terwijl er nauwkeurige controle over de lipidensamenstelling en membraanmechanica behouden blijft. Deze mogelijkheid ondersteunt het mechanistische risico-onderzoek naar therapeutische targets door kanaal-membraaninteracties onder fysiologisch relevante condities te verduidelijken. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door een reproduceerbaar platform te bieden voor de functionele validatie van ionkanaaltargets.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de functie van ionkanalen in gedefinieerde lipideomgevingen te bestuderen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets via reproduceerbare enkelkanaal-stroommetingen met een lage elektrische ruis.
- Voorspellende waarde: Faciliteert biologische risicoreductie door te verhelderen hoe de lipidsamenstelling de kanaalactiviteit en -stabiliteit moduleert.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde lipide dubbellaagsystemen voor voor downstream compound screening door middel van de incorporatie van kanaal-gereconstitueerde liposomen.
- Operationele waarde: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via gecontroleerde belvorming en consistente vernieuwing van de dubbellaag.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform door herhaalde cycli van CBB-vorming en disruptie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Behoudt de relevantie van de ontdekking tot aan het preklinische werk door ziekte-relevante lipidensamenstellingen te modelleren.
- Mechanische risicoreductie: Maakt het mogelijk om te beoordelen hoe membraanperturbaties de kanaalfunctie beïnvloeden, wat bijdraagt aan voorspellingen over veiligheid en effectiviteit.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de identificatie van lipidafhankelijke kanaalfenotypes die kunnen correleren met klinische responsen.
Pipeline- & Workflowintegratie
De CBB-methode past binnen het continuüm van ontdekking, van targetvalidatie tot leadidentificatie, en biedt een lipid-controleerbaar platform voor de karakterisering van ionkanalen voorafgaand aan compound-screening.
- Discoverybiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden door gecontroleerde variatie van de membraanlipidensamenstelling mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door reproduceerbare vorming van dubbellagen en stabiele incorporatie van ionkanalen.
- Analytica: Biedt kwantitatieve read-outs van enkelkanaalstromen, waardoor vergelijking van kanaalgedrag onder verschillende condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinisch werk door de studie van kanaal-membraaninteracties in lipidomgevingen die relevant zijn voor ziektebeelden mogelijk te maken.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Fungeert als een hernieuwbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek, wat duurzaam gebruik over verschillende projecten heen ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in target-validatie door mechanistische ambiguïteit in kanaal-membraaninteracties te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door gecontroleerde instandhouding van de belgrootte en vernieuwing van de dubbellaag.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdig in de discovery-fase betrouwbare functionele gegevens over ionkanaal-targets te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van ionkanaalprogramma's mogelijk op basis van gevalideerde membraanafhankelijke activiteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de omgang met lipiden, elektrofysiologie en microfluïdische manipulatie.
- Is afhankelijk van patch-clampversterkers, glascapillaire pullers en micro-injectoren voor belvorming en drukcontrole.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de bereiding van lipiden, controle van de belgrootte en reinigingsprotocollen.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van de methode op verschillende typen ionkanalen of lipidenmengsels.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van nauwkeurig behoud van de belgrootte en het vermijden van contaminatie tijdens de bereiding van de pipet.
