Lipide dubbelgelaagde experimenten met Contact Bubble Bilayers voor Patch-Clampers

De Contact Bubble Bilayer methode is een alternatieve techniek voor conventionele Lipid Bilayers. en deze methode maakt meer veelzijdige trillingen door het membraan mogelijk. De CBB methode integreert de voordelen van Planar Lipid Bilayer en patch clamp methode.

Als lipidebilayertechniek kan een CBB met een willekeurige lipidesamenstelling worden gevormd. We hebben een CBB ontwikkeld voor single channel stroomopnames met een hoge signaal-ruisverhouding. Deze methode maakt variëteiten van membraan trillingen en biedt een enorm type platform aan de kanaalmembraan interface.

Iedereen heeft ervaren blazen een zeepbel. De gelijkaardige manoeuvres worden genomen voor de vorming CBB door de toegepaste druk eerder dan het blazen door mond manueel te verfijnen. Oefen en geniet van de CBB.

Om deze procedure verspreiden fosfolipiden in chloroform bij een gewenste concentratie in een ronde bodemkolf. Plaats de fosfolipidenoplossing op een roterende verdamper die is aangesloten op een stikstofgascilinder. Draai de kolf onder stikstofstroom bij kamertemperatuur tot er een dunne fosfolipidefilm verschijnt.

Plaats vervolgens de open kolf in een desiccator die is aangesloten op een vacuümpomp. Met behulp van de vacuümpomp de binnenkant van de desiccator gedurende enkele uren aanzuigen om de chloroform grondig te verwijderen. Voeg vervolgens een passend volume elektrolytoplossing toe aan de kolf en hang de fosfolipiden op om een twee milligrma per milliliter fosfolipidensuspensie te verkrijgen.

Sonciate de schorsing voor 20 tot 30 seconden met behulp van een bad sonicator om een meerlaagse vesicle schorsing te verkrijgen. Voor de bereiding van proteoliposomen die ionenkanaaleiwitten bevatten, voegt u een eiwitoplossing toe aan de meerlaagse vesicle suspensie. En sonicate voor enkele seconden met behulp van het bad sonicator.

Om grote boring glazen pipetten voor te bereiden, plaatst u een glazen capillair in een pipettrekker en fabriceert u de micropipet met een fijne taps toelopende punt door middel van twee stappen trekken. Zet vervolgens de micropipet op een microsmederij en neem contact op met de punt van de micropipet op een platina filament op het taps toelopende gedeelte met een diameter van 30 tot 50 micrometer. Verwarm de gloeidraad kort en zet hem onmiddellijk uit.

Met behulp van gedestilleerd water en ethanol schoon het oppervlak van het glas glijbaan met een ondiepe put. Breng vervolgens het siliconen reagens aan op de glasplaat en laat het reagens volledig in de lucht drogen. Plaats vervolgens de glazen schuif op het podium van een omgekeerde microscoop.

Voeg 100 microliter hexadecane toe in de ondiepe put van de siliconen glazen schuif. Met behulp van een tuberculine spuit vul de elektrolyt oplossing tot de helft van de lengte van de micropipet. Zet vervolgens de micropipet met de drukpoort op de micropipethouder, waardoor de zilver/zilverchloridedraadelektrode in de pipetelelektrolytoplossing kan weken.

Sluit een van de micropipette houders aan op het hoofdstadium van een patchklemversterker en de andere met de elektrische grond. Sluit vervolgens een microinjector aan op de drukpoort van de micropipethouder. Pas de micropipet aan op een geschikte positie boven het stadium van een omgekeerde microscoop met behulp van de micromanipulator.

Om het elektrodeverschuivingspotentieel aan te passen, plaatst u een microliter van dezelfde elektrolytoplossing die wordt gebruikt om de micropipet op het vlakke oppervlak rond de ondiepe put van de glazen glijbaan te vullen om een elektrolytkoepel te creëren. Week de punt van beide micropipetten in de elektrolytkoepel. Pas daarna het elektrodeverschuivingspotentieel van de patchklemversterker aan.

Om de liposoom oplossing van de tip te trekken, voeg een microliter liposoom oplossing op het vlakke oppervlak rond de ondiepe put van het diaglas. Plaats vervolgens het puntje van de micropipet in het liposoom met koepel. Aspirate de liposoom bevattende oplossing met behulp van de microinjector.

Herhaal de procedure voor de andere mircopipette voor aspirating kanaal gereconstitueerde liposomen. Plaats nu de micropipet in de hexadecane in de ondiepe put. Blaas een waterbel langzaam door het verhogen van de druk tot de bel bereikt de gewenste grootte en behoud dezelfde druk daarna.

Gooi de bel door het passeren van de tip door de olie-air interface als het moeilijk is om de grootte van de zeepbel stabiel te houden. Herhaal de procedures totdat twee stabiele bellen worden gevormd. Stel een contact tussen de twee bubbels.

Stem de druk af om de belgrootte te behouden, omdat de grootte zelfs bij de constante intrabeldruk geleidelijk kan veranderen. Stel het membraanpotentieel in op de juiste waarde met behulp van de patchclaimversterker en wacht tot de kanaalstroom naar voren komt. Voor stabiele lipide bilayer vorming is het essentieel om de blotters schoon te maken.

Glascapillaire of pipetpreparaat moet grondig worden gewassen en besmetting door de wasmiddelmoleculen voorkomen. Zodra de CBB had gevormd het kanaal moleculen, hetzij in waterige oplossing of in het liposoom werden spontaan ingevoegd in de bilayer binnen de spanwijdte van een paar tot tientallen minuten. Het inbrengen van de kanalen werd bevestigd door de stapsgewijze toename van de huidige amplitude onder het toegepaste membraanpotentieel.

Een bilayer gevormd door de CBB-methode kan worden uiteengevallen in twee monolagen. De pTB-kanaalstroom kwam onmiddellijk na het bevestigen van de twee monolagen tevoorschijn. En de stroom werd groter als de zijn van contact verhoogd de amplitude van de stroom werd gesynchroniseerd met de detach hechten manipulatie van de CBB.

Als het aantal blow outs van bellen verhoogt de lipide concentratie in de waterige oplossing afneemt en de monolaag niet wordt gevormd. Probeer dan om de druk op liposoom sectie te verlichten. Zodra de CBB formatie en kanaal reconstitutie zijn vastgesteld u proberen om samenstellingen van waterige oplossing en membraan variëren via profusie of het injecteren van een hydrofiele of hydrofobe stoffen.

De CBB-methode heeft veelzijdige manieren geopend om kanaalmembraan samenspel te verkennen.