Analyse van de lipidesamenstelling van mycobacteriën door dunnelaagchromatografie

Mycobacteriën Lipiden zijn een belangrijk kenmerk van het geslacht en zijn van cruciaal belang in gastheer Mycobacteriën interacties. Snelheid en veelzijdigheid zijn de belangrijkste voordelen van deze procedure. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van lipiden en de pathogeniciteit van mycobacteriën en hun immunostimulerende effect te begrijpen.

Voeg voor de niet-covalente gekoppelde lipidenextractie 15 milliliter van één tot twee chloroform toe aan methanoloplossing aan een glazen buis met een PTFE-voeringschroefdop onder een laminaire stroomkap. Krab vervolgens 200 milligram mycobacteriën uit een vast medium en voeg de mycobacteriën toe aan de glazen buis. Incubeer de buis een nacht met constant roeren.

Filter de volgende dag de organische oplosmiddelen door een glazen trechter bekleed met filtreerpapier in een glazen buis. Na gebruik van stikstofgasflux, om de vloeibare fase in de buis te verdampen, vult u de buis met stikstofgas en slaat u de buis op bij vier graden Celsius. Voeg vervolgens 15 milliliter van een twee tot één chloroform toe aan methanoloplossing aan het cellulaire vuil en incubeer de buis een nacht met constant roeren.

Laat het mengsel de volgende ochtend een uur rusten voordat u een Pasteur-pipet gebruikt om de organische oplosmiddelen in een met filterpapier beklede glazen trechter in dezelfde glazen opvangbuis over te brengen. Verdamp vervolgens de vloeibare fase zoals gedemonstreerd, voordat u de buis bijvult met stikstofgas voor opslag van vier graden Celsius. Voeg voor mycolzuurextractie twee tot vijf milliliter van een roeroplossing en 200 milligram mycobacteriënbiomassa toe aan een hermetische glazen buis met een PTFE-voeringschroefdop en meng de inhoud door vortexing.

Incubeer het mengsel 's nachts in een droog bad bij 80 graden Celsius. De volgende dag, wanneer de buis op kamertemperatuur is afgekoeld, voegt u twee milliliter N-hexaan toe en mengt u de inhoud gedurende 30 seconden door vortexing. Laat de buis bezinken totdat er twee heldere fasen verschijnen en breng de bovenste N-hexaanfase over naar een nieuwe buis.

Meng twee extra milliliter N-hexaan met de buisinhoud en verzamel de bovenste laag opnieuw. Verdamp vervolgens de buisinhoud door middel van een stikstofstroom en sla het met stikstof bedekte monster op bij vier graden Celsius, zoals aangetoond. Om de monsters door TLC te analyseren, bedekt u een wand van de TLC-kamer met een stuk filterpapier, voegt u vaseline toe aan de hoeken van de kamer om de kamer af te sluiten, om het oplosmiddelmengsel over het filterpapier te laten gaan en het resterende volume van het oplosmiddel toe te voegen aan de bodem van de TLC-kamer.

Sluit de TLC-kamer gedurende ten minste 20 minuten tot verzadigd. Los ondertussen de lipiden in de glazen buis op in 200 tot 1000 microliter chloroform en gebruik een capillaire glazen buis om 10 microliter van de lipide chloroform-suspensie rechtstreeks op de TLC-plaat aan te brengen. Nadat u het monster vijf minuten hebt laten drogen, plaatst u de plaat in de verzadigde TLC-kamer en laat u de mobiele fase door de TLC lopen.

Wanneer het oplosmiddel een centimeter van het bovenste uiteinde van de plaat bereikt, plaatst u de plaat onder laminaire flux totdat het silica volledig droog is. Spuit vervolgens de gedroogde plaat met 15 tot 20 milliliter 10% molair data fosforzuurhydraat in ethanol tot de plaat felgeel is en verwarm de plaat gedurende twee tot vijf minuten op 120 graden Celsius. In deze representatieve analyse werd het mycolzuur geëxtraheerd uit verschillende mycobacteriënsoorten geanalyseerd door middel van eendimensionale TLC met behulp van twee verschillende elutiesystemen en tweedimensionale TLC.

Twee soorten methylatieprocedures werden ook uitgevoerd om de aanwezigheid van type vijf mycolzuur te bevestigen. In beide elutiesystemen bevonden de mycolzuren zich ongeveer in het midden van de plaat, hoewel de vlek die overeenkomt met type vijf mycolzuur pas na verzeping werd waargenomen. Tweedimensionale TLC maakt ook de identificatie van individuele mycolische zuurtypen mogelijk.

Mycobacterium brumae drukt bijvoorbeeld alleen type één mycolzuren uit, mycobacterium bovis BCG drukt type één en vier uit, mycobacterium fortuitum drukt type één en vijf uit en mycobacterium abcessus drukt type één en twee mycolzuurprofielen uit. De totale lipide-extracten van verschillende mycobacteriënsoorten werden geanalyseerd in functie van hun polariteit en grootte. Het laat zien dat de meeste A polaire lipiden, zoals PDIMs, aanwezig zijn in mycobacterium bovis BCG, maar niet in mycobacterium fortuitum, mycobacterium brumae en het gladde morfotype van M abcessus.

Fenolglycollipiden zijn alleen aanwezig in mycobacterium bovis BCG, terwijl GlycoPeptidoLipiden alleen worden waargenomen in monsters van mycobacterium abcessus. Net als bij mycolzuren kunnen acylglycerolen en PDIMs, PIMs, ook gemakkelijk worden gevisualiseerd door middel van eendimensionale TLC- of 2D TLC-analyse. Twee soorten vlekken werden gebruikt om PIMs in eendimensionale TLC te onthullen.

Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van dit protocol is om tijdens de procedure geen plastic instrumenten te gebruiken.