Visualisatie van membraanrommelvorming met behulp van Scanning Electron Microscopie
27 mei 2021
Macropinocytose is een sterk geconserveerd endocytisch proces geïnitieerd door de vorming van F-actine-rijke plaatachtige membraanprojecties, ook bekend als membraanrulingen. Verhoogde snelheid van macropinocytotische opgeloste stof internalisatie is betrokken bij verschillende pathologische aandoeningen. Dit protocol presenteert een methode om de vorming van membraanrommels in vitro te kwantificeren met behulp van scanning elektronenmicroscopie.
Het huidige SEM-beeldvormingsprotocol biedt een hulpmiddel om membraanrommelvorming, cirkelvormige uitsteeksels en macropinocytische cups op het celoppervlak in vitro te visualiseren en te kwantificeren. SEM biedt beelden met een hoge resolutie van het celoppervlak die kunnen worden gebruikt om macropinocytische membraanactiviteiten te visualiseren. Deze techniek kan worden gebruikt om nieuwe signaalroutes te ontdekken die macropinocytose reguleren en nieuwe stimulatoren en remmers van micropinocytose te identificeren.
Begin met het plaatsen van steriele glazen afdeksels in putten van een 24-putplaat met behulp van een geautoclaveerde tang. Zaai vervolgens ruwe 264,7 macrofagen op de afdekslips met een dichtheid van 10 tot de zesde cellen per milliliter en incubeer de plaat een nacht in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vervang de volgende dag de media in elke put door 500 microliter verse complete media en behandel de macrofagen vervolgens gedurende 30 minuten voor met een voertuigcontrole zoals DMSO of een macropinocytoseremmer zoals EIPA.
Om vervolgens membraanrommel te bevorderen, behandelt u de cellen gedurende 30 minuten met macropinocytosestimulatoren, zoals een één-micromolaire PMA-oplossing of 100 nanogram per milliliter macrofaagkoloniestimulerende factor. Om de cellen te fixeren voor scanning elektronenmicroscopie, zuigt u de media uit de putten en wast u de afdekzeilslips twee keer met ijskoude PBS en incubeert u vervolgens de afdekslips in een fixatief gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende dag, zonder de celmonolaag te verstoren, was en incubeer vervolgens de afdeksels in 500 microliter 0,1-motor natriumcacodylaat gedurende 15 minuten.
Na twee wasbeurten met 500 microliter gedestilleerd water, wast u de afdekking twee keer in 500 microliter van een gesorteerde ethanolserie met een incubatie van 10 minuten in elke wasbeurt. Om het drogen van kritieke punten uit te voeren, plaatst u de afdekzeilslips in een droger met kritieke punten en bedekt u ze met 100% ethanol. Druk vervolgens op de aan / uit-knop en open de kooldioxidetank.
Druk ongeveer 30 seconden op de koelknop totdat de temperatuur daalt tot nul graden Celsius. Druk vervolgens op de vulknop totdat er een bel in het kamervenster verschijnt. Druk vervolgens op de spoelknop totdat de geur van ethanol uit de spoeluitlaat verdwijnt.
Druk vervolgens nogmaals op de koelknop totdat de temperatuur daalt tot nul graden Celsius. Druk opnieuw op de knoppen Vol en verwijder ze om ze uit te schakelen. Sluit vervolgens de kooldioxidetank.
Druk opnieuw op de koele bodem om deze uit te schakelen en druk vervolgens op de warmteknop. Stel de temperatuur in op 42 graden Celsius en de druk op 1.200 pond per vierkante inch. Zodra de druk en temperatuur stabiliseren, drukt u op de ontluchtingsknop om de druk langzaam te laten afnemen.
Zodra de kamerdruk 150 pond per vierkante inch bereikt, drukt u op de ontluchtingsbodem en wacht u tot de druk afneemt tot nul pond per vierkante inch. Schakel de kritische puntdroger uit en verwijder de afdekslipjes. Monteer vervolgens met behulp van koolstofklevende kranen de afdekslips op de aluminium monsterbevestigingen voor scanningelektronenmicroscopie en ga vervolgens verder met sputtercoating met goud of palladium in een sputtercoater.
Schakel de aan/uit-knop van de sputtercoater in. Nadat het vacuüm 30 millitorrs heeft bereikt, spoelt u de kamer om vocht en lucht te verwijderen door de gasschakelaar uit te schakelen en de fijne gasklep tegen de klok in te draaien. Zodra het vacuüm toeneemt tot 200 millitorrs, schakelt u de gasschakelaar uit en wacht u tot het vacuüm 30 millitorrs bereikt.
Spoel vervolgens de kamer opnieuw om vocht en lucht te verwijderen zoals aangetoond. Nadat u de kamer drie keer hebt gespoeld, drukt u op de onderkant van de timer en past u de spanningsknop aan totdat de meter 10 milliamperes aangeeft. Verwijder vervolgens de gecoate afdekslipjes uit de kamer.
Om de membraanruches te visualiseren en te kwantificeren, plaatst u de monsterafdekking in de kamer van een scanning-elektronenmicroscoop, sluit u de deur en drukt u op de evac-knop. Open de microscoopbedieningssoftware en stel de versnellingsspanning in op 15 kilovolt en de werkafstand op 10 millimeter. Druk op de knop Coördinaten en beweeg rond de controller totdat de cellen in het midden van het observatiescherm verschijnen.
Stel de vergroting in op 3, 500 X en maak een afbeelding van het voorbeeld door op de knop Foto te klikken. Hier zijn representatieve scanning elektronenmicroscopie beelden, die membraan ruches vorming in ruwe 264.7 macrofagen aantonen na behandeling met PMA en macrofaag kolonie stimulerende factor. Voorbehandeling van macrofagen met de macropinocytoseremmer EIPA verzwakt de vorming van membraanrommels.
Tijdens de vorming van ruches ondergaat het plasmamembraan verschillende morfologische stadia, waaronder een plaatachtig membraanuitsteeksel, een C-vormige membraanruche en een macropinocytische beker. Membraanroesvorming na PMA- en macrofaagkoloniestimulerende factorbehandelingen kan worden gekwantificeerd met behulp van scanningelektronenmicroscopie, terwijl macropnersoomvorming kan worden bevestigd door alternatieve beeldvormingstechnieken, zoals confocale microscopie met behulp van Texas red dextran en FM4-64. De blauwe pijlen geven membraanrommel aan, terwijl de gele en groene pijlen naar de micropinosomen wijzen.
Ten slotte kan macropinocytose worden bevestigd en gekwantificeerd door middel van flowcytometrie met behulp van een fluorescerende vloeistoffasemarker zoals FITC of Texas red dextran. Naast SEM kan ook live cell imaging en flowcytometrie-analyse van fluorescerend gelabelde dextran internalisatie worden uitgevoerd om macropinocytose te onderzoeken en te kwantificeren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om de vorming van membraanplooien en macropinocytische activiteit te visualiseren en te kwantificeren met behulp van rasterelektronenmicroscopie (REM). Het benadrukt het belang van macropinocytose bij verschillende pathologische aandoeningen.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Macropinocytose is een geconserveerd endocytisch proces.
- Het omvat de vorming van membraanplooien aangedreven door F-actine.
- Verhoogde macropinocytose is gekoppeld aan verschillende ziekten.
- REM biedt beeldvorming met hoge resolutie van cellulaire structuren.
Doel van de studie
- Om membraanplooien en macropinocytische cups te visualiseren.
- Om de vorming van membraanplooien in vitro te kwantificeren.
- Om signaalroutes te identificeren die macropinocytose reguleren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van steriele glazen dekglasjes in een 24-wellsplaat.
- Aanleggen van RAW 264.7 macrofagen bij een gespecificeerde dichtheid.
- Incubatie van cellen in een bevochtigde omgeving.
- Gebruik van REM voor beeldvorming van membraanactiviteiten.
Belangrijkste resultaten
- Beeldvorming met hoge resolutie van membraanplooien werd verkregen.
- Kwantificering van macropinocytische activiteit werd bereikt.
- Mogelijke signaalroutes werden geïdentificeerd.
- Effecten van remmers op macropinocytose werden beoordeeld.
Conclusies
- REM is een effectief hulpmiddel voor het bestuderen van macropinocytose.
- Het protocol kan helpen bij het ontdekken van nieuwe regulerende factoren van dit proces.
- Begrip van macropinocytose kan leiden tot inzichten in ziektemechanismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visualizing membrane ruffle formation via SEM enables direct observation of macropinocytic activity, a key endocytic mechanism implicated in nutrient uptake, antigen presentation, and pathogen invasion. This imaging approach supports target validation by linking morphological changes to pharmacological modulation, aiding in the de-risking of early-stage hypotheses. Quantifiable surface dynamics provide a phenotypic readout for screening modulators of macropinocytosis in disease-relevant models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating stimulator/inhibitor treatment with quantifiable changes in membrane ruffle formation.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible imaging readout for assessing compound effects on macropinocytic activity.
- Predictive Value: Supports lead identification by identifying compounds that attenuate or enhance ruffle formation as a proxy for pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative morphological data (ruffle count, cup formation) suitable for high-content analysis and hit validation.
- Reproducibility: Standardized fixation and imaging protocols enable cross-experiment comparison and assay robustness.
- Scalability: Compatible with multi-well formats, allowing parallel testing of stimulators, inhibitors, or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links macropinocytic activity to physiological and pathological processes, supporting relevance in cancer, inflammation, and infectious disease models.
- Translational Continuity: Enables correlation of SEM-derived morphological data with functional assays (e.g., dextran uptake) for mechanistic validation.
- Risk Mitigation: Reduces ambiguity in target engagement by providing direct visual evidence of pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The SEM-based visualization of membrane ruffles fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and feeding into lead identification through phenotypic screening of macropinocytic modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing the effects of growth factors, cytokines, or pharmacological agents on membrane dynamics.
- Screening: Enables assay development for quantifying ruffle formation as a functional output in compound screening campaigns.
- Analytics: Provides morphometric data (ruffle frequency, cup closure) that can be normalized and compared across conditions to assess bioactive compound effects.
- Translational Research: Connects imaging findings to functional validation via complementary techniques like flow cytometry or confocal microscopy for fluid-phase uptake.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying macropinocytosis across multiple cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct visualization of membrane dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs via fixed protocols for sample preparation, imaging, and quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking compound treatment to observable phenotypic changes in macropinocytic activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated effects on a disease-relevant endocytic pathway.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fixation, and SEM operation for reliable imaging of membrane protrusions.
- Depends on access to SEM, critical point dryer, and sputter coater for sample preparation and imaging.
- Necessitates standardization across teams for consistent stimulation, fixation, and imaging parameters to ensure data comparability.
- Adaptation to primary cells or alternative models may require optimization of seeding density and stimulation conditions.
- Practical limitations include inability to capture dynamic processes in real time and reliance on fixed-cell endpoints.
