Visualisatie van membraanrommelvorming met behulp van Scanning Electron Microscopie

Het huidige SEM-beeldvormingsprotocol biedt een hulpmiddel om membraanrommelvorming, cirkelvormige uitsteeksels en macropinocytische cups op het celoppervlak in vitro te visualiseren en te kwantificeren. SEM biedt beelden met een hoge resolutie van het celoppervlak die kunnen worden gebruikt om macropinocytische membraanactiviteiten te visualiseren. Deze techniek kan worden gebruikt om nieuwe signaalroutes te ontdekken die macropinocytose reguleren en nieuwe stimulatoren en remmers van micropinocytose te identificeren.

Begin met het plaatsen van steriele glazen afdeksels in putten van een 24-putplaat met behulp van een geautoclaveerde tang. Zaai vervolgens ruwe 264,7 macrofagen op de afdekslips met een dichtheid van 10 tot de zesde cellen per milliliter en incubeer de plaat een nacht in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vervang de volgende dag de media in elke put door 500 microliter verse complete media en behandel de macrofagen vervolgens gedurende 30 minuten voor met een voertuigcontrole zoals DMSO of een macropinocytoseremmer zoals EIPA.

Om vervolgens membraanrommel te bevorderen, behandelt u de cellen gedurende 30 minuten met macropinocytosestimulatoren, zoals een één-micromolaire PMA-oplossing of 100 nanogram per milliliter macrofaagkoloniestimulerende factor. Om de cellen te fixeren voor scanning elektronenmicroscopie, zuigt u de media uit de putten en wast u de afdekzeilslips twee keer met ijskoude PBS en incubeert u vervolgens de afdekslips in een fixatief gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende dag, zonder de celmonolaag te verstoren, was en incubeer vervolgens de afdeksels in 500 microliter 0,1-motor natriumcacodylaat gedurende 15 minuten.

Na twee wasbeurten met 500 microliter gedestilleerd water, wast u de afdekking twee keer in 500 microliter van een gesorteerde ethanolserie met een incubatie van 10 minuten in elke wasbeurt. Om het drogen van kritieke punten uit te voeren, plaatst u de afdekzeilslips in een droger met kritieke punten en bedekt u ze met 100% ethanol. Druk vervolgens op de aan / uit-knop en open de kooldioxidetank.

Druk ongeveer 30 seconden op de koelknop totdat de temperatuur daalt tot nul graden Celsius. Druk vervolgens op de vulknop totdat er een bel in het kamervenster verschijnt. Druk vervolgens op de spoelknop totdat de geur van ethanol uit de spoeluitlaat verdwijnt.

Druk vervolgens nogmaals op de koelknop totdat de temperatuur daalt tot nul graden Celsius. Druk opnieuw op de knoppen Vol en verwijder ze om ze uit te schakelen. Sluit vervolgens de kooldioxidetank.

Druk opnieuw op de koele bodem om deze uit te schakelen en druk vervolgens op de warmteknop. Stel de temperatuur in op 42 graden Celsius en de druk op 1.200 pond per vierkante inch. Zodra de druk en temperatuur stabiliseren, drukt u op de ontluchtingsknop om de druk langzaam te laten afnemen.

Zodra de kamerdruk 150 pond per vierkante inch bereikt, drukt u op de ontluchtingsbodem en wacht u tot de druk afneemt tot nul pond per vierkante inch. Schakel de kritische puntdroger uit en verwijder de afdekslipjes. Monteer vervolgens met behulp van koolstofklevende kranen de afdekslips op de aluminium monsterbevestigingen voor scanningelektronenmicroscopie en ga vervolgens verder met sputtercoating met goud of palladium in een sputtercoater.

Schakel de aan/uit-knop van de sputtercoater in. Nadat het vacuüm 30 millitorrs heeft bereikt, spoelt u de kamer om vocht en lucht te verwijderen door de gasschakelaar uit te schakelen en de fijne gasklep tegen de klok in te draaien. Zodra het vacuüm toeneemt tot 200 millitorrs, schakelt u de gasschakelaar uit en wacht u tot het vacuüm 30 millitorrs bereikt.

Spoel vervolgens de kamer opnieuw om vocht en lucht te verwijderen zoals aangetoond. Nadat u de kamer drie keer hebt gespoeld, drukt u op de onderkant van de timer en past u de spanningsknop aan totdat de meter 10 milliamperes aangeeft. Verwijder vervolgens de gecoate afdekslipjes uit de kamer.

Om de membraanruches te visualiseren en te kwantificeren, plaatst u de monsterafdekking in de kamer van een scanning-elektronenmicroscoop, sluit u de deur en drukt u op de evac-knop. Open de microscoopbedieningssoftware en stel de versnellingsspanning in op 15 kilovolt en de werkafstand op 10 millimeter. Druk op de knop Coördinaten en beweeg rond de controller totdat de cellen in het midden van het observatiescherm verschijnen.

Stel de vergroting in op 3, 500 X en maak een afbeelding van het voorbeeld door op de knop Foto te klikken. Hier zijn representatieve scanning elektronenmicroscopie beelden, die membraan ruches vorming in ruwe 264.7 macrofagen aantonen na behandeling met PMA en macrofaag kolonie stimulerende factor. Voorbehandeling van macrofagen met de macropinocytoseremmer EIPA verzwakt de vorming van membraanrommels.

Tijdens de vorming van ruches ondergaat het plasmamembraan verschillende morfologische stadia, waaronder een plaatachtig membraanuitsteeksel, een C-vormige membraanruche en een macropinocytische beker. Membraanroesvorming na PMA- en macrofaagkoloniestimulerende factorbehandelingen kan worden gekwantificeerd met behulp van scanningelektronenmicroscopie, terwijl macropnersoomvorming kan worden bevestigd door alternatieve beeldvormingstechnieken, zoals confocale microscopie met behulp van Texas red dextran en FM4-64. De blauwe pijlen geven membraanrommel aan, terwijl de gele en groene pijlen naar de micropinosomen wijzen.

Ten slotte kan macropinocytose worden bevestigd en gekwantificeerd door middel van flowcytometrie met behulp van een fluorescerende vloeistoffasemarker zoals FITC of Texas red dextran. Naast SEM kan ook live cell imaging en flowcytometrie-analyse van fluorescerend gelabelde dextran internalisatie worden uitgevoerd om macropinocytose te onderzoeken en te kwantificeren.