Array Tomography Workflow voor de gerichte acquisitie van volume-informatie met behulp van Scanning Electron Microscopy

Elektronenmicroscopie-analyse is vaak complex. Wij zijn van mening dat ons protocol de verwerking en verwerving van de EM-gegevens van het grote monsteroppervlak en het tussenvolume vergemakkelijkt. Ons protocol helpt bij het vinden van doelstructuren in seriële secties.

Gegevensregistratie is beperkt tot wat nodig is. In vergelijking met data-acquisitie in hele weefselblokken wordt de opnametijd verkort en data-analyse eenvoudiger. Gezien het algehele gemak van de aanpak, geloven we dat het kan worden gebruikt om niet alleen wetenschappelijke vragen aan te pakken, maar ook als een diagnostisch hulpmiddel.

Om een array voor analyse te genereren, klemt u het monster eerst op een ultramicrotome houder en gebruikt u een scheermesje om de hars rond het monster ruwweg te trimmen. Gebruik een diamantsnijgereedschap om het monster fijn te snijden en gebruik snijmessen met een helling van 20 of 90 graden om ervoor te zorgen dat de boven- en onderkant van het blok evenwijdig zijn aan de snijkant van het mes. Meng xyleen en lijm in een verhouding van 3:1 en gebruik een wimper die aan een tandenstoker is bevestigd om het mengsel op de boven- en onderrand van het bijgesneden blok aan te brengen.

Gebruik tijdens het drogen van het mengsel een waferklieven om een stuk wafer op de juiste grootte voor de analyse te snijden. Reinig de wafer in gedestilleerd water om vuil weg te spoelen en reinig het oppervlak met plasma nadat de wafer droog is. Om een array tomografie mes te bereiden, gebruik je schuimende plakband om een naald aan de onderkant van een histo jumbo mes te bevestigen en plaats je het mes in de ultra microtome houder op nul graden.

Stel de rand van het mes evenwijdig aan het blokoppervlak aan en breng het bijgesneden blok naar de rand van het mes in een positie die klaar is voor sectie. Plaats de schone wafel in het mesbassin en vul het bassin met water tot hetzelfde niveau als de mesrand, laat vervolgens de diamantrand van het mes goed bevochtigen, gebruik de bijgevoegde spuit om water toe te voegen of op te zuigen als dat nodig is. Voor array-sectie stelt u de microtoom in op een snijbereik van 50 tot 100 nanometer en een snijsnelheid van 6 tot 1 millimeter per seconde en begint u met secties om een lint te verkrijgen dat lang genoeg is om een gericht Z-volume te bedekken.

Afhankelijk van de blokgrootte, homogeniteit van het weefsel en het type hars, zal het lint ongeveer recht zijn. Gebruik een schone, niet-kleverige punt van een wimper om de linten los te maken van de mesrand. Gebruik de wimper om het lint voorzichtig naar het midden van het steunmedium te verplaatsen.

Chloroform of een verwarmingspen kan worden gebruikt om de sectie indien nodig uit te rekken. Trek na het uitrekken de spuit terug om te beginnen met het aftappen van het water. Voor delicatere linten of een langzamere terugtrekking van het water, maakt u de spuit los van de slang om het water te laten druppelen.

Wanneer het waterniveau het waferniveau bereikt, duwt u het lint voorzichtig naar het midden van het bassin en blijft u draineren totdat al het resterende water volledig uit het bassin is verwijderd. Laat de wafer drogen in een schone omgeving. Het drogen duurt ongeveer 30 minuten.

Wanneer het monster volledig is gedroogd, brengt u de array over naar een goed gesloten doos om het te beschermen tegen vuilverontreiniging. En zet de doos minstens 30 minuten in een oven van 60 graden Celsius. Als u een overzichtskaart van SEM-afbeeldingen wilt verkrijgen die sectielocaties op de wafer onthult, gebruikt u de ingebouwde optische camera om een SEM-afbeelding te verkrijgen die een lint van secties bedekt.

Als u een mozaïek wilt maken, klikt en sleept u de cameraafbeelding van het monster en start u de automatische acquisitie. Verkrijg overzichten met een hogere resolutie om doelstructuren te vinden. Als slechts een paar secties moeten worden afgebeeld, gebruikt u een zoombare viewer om verkregen afbeeldingen op hun oorspronkelijke locaties te bekijken.

Zodra een sectie is geïdentificeerd die met hoge resolutie moet worden afgebeeld, klikt en sleept u om een beeldgebied te maken, selecteert u Vervolgens Beeldinstellingen met hoge resolutie en slaat u de instellingen op in een sjabloon Om bijzonder kleine of moeilijk te detecteren zeldzame gebeurtenissen te vinden, gebruikt u de beeldinstellingen met hoge resolutie op elke 10e sectie of op één sectie per lint om handmatig een beeldgebied te maken en de afbeeldingen te verkrijgen. Bekijk vervolgens de afbeeldingen en markeer secties die het interessante gebied bevatten. Als u meer dan 10 opeenvolgende secties wilt verkrijgen, gebruikt u de sectiezoeker om alle secties automatisch te vinden.

Als de overzichtsafbeeldingen geen duidelijke interessegebieden weergeven, verkrijgt u afbeeldingen met een hogere resolutie van de secties en gebruikt u de sectievoorbeeldfunctie om de afbeeldingen automatisch te maken en te verkrijgen. Om de optimale beeldvormingsinstellingen te bepalen, activeert u de live beeldvorming in de microscoopbesturingssoftware en navigeert u naar één interessegebied en past u vervolgens de beeldinstellingen aan totdat de afbeeldingen duidelijke interessegebieden laten zien, maar zonder een te lange beeldacquisitie, volgens de richtlijnen van de fabrikant. Als u de positionering van de afbeeldingsgebieden op opeenvolgende secties wilt optimaliseren, zoomt u in op de gewenste afbeelding en klikt u op Verfijning van positie starten om de precisie van geregistreerde sectielocaties te vergroten.

Als u een afbeeldingsgebied wilt definiëren, klikt en sleept u op een sectie terwijl u de Alt-toets ingedrukt houdt en selecteert u Array voor tegelset maken in het pop-upcontextmenu. De software maakt beeldgebieden op dezelfde relatieve locatie in alle secties die zijn gevonden of eerder zijn gemarkeerd. Stel vervolgens het aantal pixels, de pixelgrootte, de tegellay-out en de pixelverblijftijd in elke afbeeldingsreeks in als dat nodig is.

Als u de automatische functie wilt configureren, maakt u een afzonderlijke afbeeldingsreeks voor automatische functies zoals gedemonstreerd en verplaatst u de afbeeldingsreeks naar een positie op de sectie die structuren met hoog contrast bevat. Stel de afbeeldingsreeks in op 1024 x 884 pixels en selecteer een pixelgrootte die overeenkomt met de hoogste resolutie die in de afbeeldingsreeks wordt gebruikt. Vink in de lijst met automatische functies Auto focus en Auto stigmator aan.

Selecteer Bisection in de besturingselementen voor acquisitiereeksen en controleer of de afbeelding van de automatische functie het eerste item in de lijst is en klik vervolgens op Alles aanschaffen om de afbeeldingsacquisitie te starten. Wanneer alle imaging-series zijn gemaakt en ingesteld, wordt de serie weergegeven in een taakwachtrij. Acquisitie met lage resolutie kan handmatig of automatisch rechtstreeks op geselecteerde delen van de sectie of een hele sectie worden uitgevoerd met behulp van enkele of mozaïekafbeeldingen, gevolgd door stiksels.

Afbeeldingen uit het geselecteerde gebied kunnen vervolgens worden verkregen met behulp van parameters met hoge resolutie om mitochondriën, kernen en microvilli te visualiseren, bijvoorbeeld Nadat de automatische verwerving van opgeloste mozaïekkaarten is geselecteerd, kunnen verschillende interessante regio's worden bijgesneden of worden gebruikt om extra lokale beeldvormingsgebieden binnen de regio's te definiëren. Hoewel verschillende gespecialiseerde celtypen in de Drosophila-darm willekeurig worden verdeeld, kunnen ze visueel worden onderscheiden na het screenen van de beelden met behulp van parameters met hoge resolutie, hetzij uit afzonderlijke secties of als een verzameling seriële afbeeldingen. Na de uitlijning kunnen de stacks worden gerenderd met behulp van verschillende softwareoplossingen.

Arraytomografie-analyse maakt het mogelijk om veel opeenvolgende secties te genereren op de enkele wafer en te worden gescreend met behulp van parameters met een lage resolutie om de algemene interessegebieden te lokaliseren. Deze gebieden kunnen worden gericht voor verdere analyse met behulp van geavanceerde acquisitieparameters. Mytotische delingen in het notum zijn bijvoorbeeld niet gemakkelijk te lokaliseren op het ultrastructurele niveau, omdat de cellen relatief groot zijn in vergelijking met de abscissiezone.

Met behulp van deze methode kunnen echter de automatische overzichtsbeelden met gemiddelde resolutie van de sprongen van 20 tot 40 secties worden gebruikt om de delende cellen te lokaliseren. De arraytomografieprocedure biedt een meer eenvoudige elektronenmicroscopiegegevensanalyse. We moedigen de kijkers aan om te investeren in het beheersen van de regeneratie en zich vertrouwd te maken met de kaartgerelateerde workflow In onze ervaring vereisen weinig onderzoeksonderwerpen de ultrastructurele analyse van hele dieren of hele organen.

Onze methode helpt bij een snelle lokalisatie van cellen en hun interactiepartners in weefsels.