Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy
March 5th, 2017
Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.
Het algemene doel van deze procedure is om de binding van een extrinsieke membraaneiwit op een nanodisc-membraanoppervlak te visualiseren door middel van negatieve kleuring met transmissie-elektronenmicroscopie als eerste stap naar hoge resolutie structuurbepaling van het eiwit. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in verschillende onderzoeksgebieden, omdat het gaat om eiwitactiviteiten die zich in en op cellulaire membranen voordoen. Het grote voordeel van deze techniek is de karakteristieke stapels van nanodisc-vormen als het eiwit zich niet aan de membranen kan binden.
Deze stapels zijn duidelijk zichtbaar door transmissie-elektronenmicroscopie. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot geneesmiddelontwikkeling, omdat verbindingen gemakkelijk kunnen worden getest op het vermogen om de membraaneiwitinteracties te blokkeren of mogelijk te maken. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de optimale omstandigheden voor monotope eiwitbinding aan uw membraan, biedt het ook een laag-resolutiestructuur van het eiwit-nanodisccomplex.
Om de procedure te starten, druk en zuiver membraanscaffolding-eiwit zoals MSP1E3D1 uit. Gebruik vervolgens een glazen spuit met een metalen naald om 305 microliter van 25 milligram per milliliter POPC in chloroform in een glazen ronde bodemfles te doseren. Laat het chloroform verdampen onder een zachte stroom stikstofgas in een afzuigkap.
Laat het resterende lipide een nacht drogen in een vacuümdesiccator. Los vervolgens het droge lipide-koekje op in 200 microliter MSP-standaardbuffer verrijkt met 100 millimolair natriumcholaat als detergent. Vortex de mengsel tot het transparant is om een suspensie van 50 millimolair POPC in buffer te verkrijgen.
Was vervolgens vijf gram hydrofobe kralen met 30 milliliter 100% methanol, vervolgens met 40 milliliter ultrapuur water en tenslotte met 10 milliliter MSP-standaardbuffer. Bewaar de kralen onder 15 milliliter standaardbuffer bij vier graden Celsius. Combineer vervolgens 190 microliter van een 0,124 millimolair oplossing van MSP1E3D1 en 61,5 microliter van een 50 millimolair suspensie van POPC in buffer, resulterend in een 1 tot 130 molair verhouding van MSP tot POPC en een natriumcholaatconcentratie van 25 millimolair.
De ideale verhouding van het lipide per MSP varieert met elke keuze van lipidetype en MSP-lens en moet worden geoptimaliseerd om een homogene bereiding van nanodiscs te verkrijgen. Incubeer het mengsel op nat ijs gedurende één uur. Voeg vervolgens de oplossing toe aan een buis met 0,5 gram gewassen hydrofobe bonen per milliliter van het reconstitutieve mengsel om nanodisczelfsamenstelling te initiëren.
Incubeer het mengsel bij vier graden Celsius gedurende 16 uur bij zeven tot acht rotaties per minuut. Laat na incubatie de kralen door zwaartekracht bezinken. Verwijder en bewaar het supernatant bij vier graden Celsius totdat het klaar is om grootte-exclusiechromatografie uit te voeren.
Voorafgaand aan grootte-exclusiechromatografie centrifugeer je het mengsel gedurende 10 minuten bij 13.000 g bij vier graden Celsius. Decanteer het supernatant en gooi de pellet weg. Equilibreer een grootte-exclusiechromatografiekolom met MSP-standaardbuffer totdat de basislijn bij 280 nanometer stabiel is.
Injecteer het supernatant in de kolom en verzamel het product in fracties van 0,5 milliliter. Meet de absorptie van de fracties bij 280 nanometer met een UV vis-spectrofotometer. Bereken de concentratie van nanodiscs met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt voor het gekozen MSP.
Om niet-denaturerende gelelektroforese uit te voeren, meng je eerst 15 microliter van het monster met vijf microliter van de juiste laadbuffer. Vul de kathodetank met licht kathodebuffer en de anodentank met runningbuffer. Laad het monster op een vier tot 16% Bis-Tris-gel en begin met de run.
Kleur de gel volgens de instructies van de gelfabrikant. Om de bereiding van een nanodisc-monotope-eiwitcomplex met vijf lipoxygenase als eiwit te beginnen, bereid je een batch MSP-standaardbuffer verrijkt met 1,5 millimolair calciumchloride. Druk het 5LO-eiwit uit en zuiver het.
Bereid onmiddellijk een 100 microliter mengsel van 0,8 micromolair 5LO en 0,8 micromolair nanodiscs in calciumverrijkte MSP-standaardbuffer. Ons voorbeeld van een monotope protease vijf lipoxygenase is afhankelijk van calcium-hoeveelheden om aan het membraan te binden. 5LO is zeer gevoelig en moet binnen een paar uur na bereiding worden gebruikt.
Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten op ijs. Bewaar het resulterende nanodisc-eiwitcomplexmonster bij vier graden Celsius gedurende maximaal één maand. Om de voorbereiding voor de TEM-analyse te beginnen, lost u één gram fosfowolfraamnatriumzout op in 50 milliliter ultrapuur water bij kamertemperatuur.
Pas de pH van de oplossing aan tot 7,4 met een 1-molare oplossing van natriumhydroxide. Filter de fosfowolfraamnatriumoplossing door een 0,22 micrometer spuitfilter en bewaar de oplossing bij kamertemperatuur. Maak vervolgens de oppervlakte van een 400-mazig koolstofcoating koperrooster hydrofiel door 20 seconden bij 30 milliampère te ontladen.
Plaats tussen 2,5 en vijf microliter van het nanodisc-monotope-eiwitcomplexmonster op het rooster en laat het monster 30 seconden rusten. Gebruik vervolgens filterpapier om overtollig oplossing van het rooster te deppen. Breng onmiddellijk een druppel fosfowolfraamnatriumoplossing aan en laat de oplossing 30 seconden rusten.
Druppel het overtollige oplossing af en laat het rooster aan de lucht drogen. Voer transmissie-elektronenmicroscopie uit met een versnelde spanning van 120 tot 200 kilovolt. Sluit afbeeldingen met lange stapels uit van verdere beeldverwerking.
Voor de geselecteerde afbeeldingen gebruikt u standaardverwerkingsmethoden om de klassegemiddelden te bepalen en om een laag-resolutie 3D-model van het nanodisc-monotope-eiwit te genereren. Met behulp van deze methode werden lege nanodiscs bereid met een 1 tot 130-verhouding van membraanscaffolding-eiwitten tot lipiden. Tijdens gro
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode om de binding van extrinsieke membraaneiwitten aan nanodisc-membranen te visualiseren met behulp van negatieve kleuring transmissie-elektronenmicroscopie. De techniek onthult hoe eiwitbinding het karakteristieke stapelen van nanodiscs kan voorkomen en biedt inzichten in eiwit-membraaninteracties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Structurele biologie
Achtergrond
- Extrinsieke eiwitten spelen cruciale rollen in celmembraanfuncties.
- Negatieve kleuring transmissie-elektronenmicroscopie is een waardevolle beeldtechniek.
- Nanodiscs worden gebruikt als modelmembranen om eiwitinteracties te bestuderen.
- Het begrijpen van eiwitbinding is essentieel voor medicijnontwikkeling en structurele biologie.
Doel van de studie
- Om de binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen te visualiseren.
- Om de implicaties van eiwitinteracties voor medicijnscreening te verkennen.
- Om een laag-resolutiestructuur van het eiwit-nanodisc-complex te verschaffen.
Gebruikte methoden
- Negatieve kleuring transmissie-elektronenmicroscopie.
- Bereiding van nanodisc-membranen.
- Bindingsassays voor extrinsieke eiwitten.
- Analyse van nanodisc-stapelingspatronen.
Belangrijkste resultaten
- Binding van extrinsieke eiwitten voorkomt de vorming van nanodisc-stapelingen.
- Karakteristiek stapelingspatronen zijn zichtbaar wanneer eiwitten niet binden.
- De methode biedt inzichten in optimale omstandigheden voor eiwitbinding.
- Mogelijke toepassingen in medicijnontwikkeling worden benadrukt.
Conclusies
- Deze techniek is effectief voor het bestuderen van eiwit-membraaninteracties.
- Het biedt een weg voor hoog-resolutie structuurbepaling.
- De bevindingen hebben implicaties voor het begrijpen van membraaneiwitfuncties.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables visualization of extrinsic membrane protein binding to nanodiscs via negative stain TEM, where protein binding prevents characteristic nanodisc stacking. It provides a rapid, low-resolution structural readout to de-risk target validation and inform early-stage drug screening for membrane-associated proteins. The approach supports go/no-go decisions by confirming binding under defined lipid and ionic conditions before committing resources to high-resolution structural work.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms membrane binding of extrinsic proteins through direct visualization of inhibited nanodisc stacking.
- Operational Value: Enables rapid assessment of protein-lipid interactions in a controlled membrane mimetic system.
- Predictive Value: Supports target validation by demonstrating binding dependence on cofactors such as calcium ions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Allows screening of compounds that modulate protein-membrane binding by measuring changes in nanodisc stacking patterns.
- Operational Value: Uses accessible negative stain TEM infrastructure for high-contrast imaging without cryo-EM requirements.
- Assay Readiness: Generates samples compatible with downstream structural workflows including single-particle analysis and non-denaturing gels.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides low-resolution structural insights that can guide higher-resolution cryo-EM studies of protein-nanodisc complexes.
- Mechanistic De-risking: Clarifies steric and spatial constraints of protein binding on both sides of the nanodisc.
- Disease-Relevant System: Models peripheral membrane protein interactions relevant to signaling pathways in inflammation and lipid metabolism.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical mechanistic studies, offering a bridge between biochemical binding assays and high-resolution structure determination.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by visualizing whether a protein binds to a membrane surface under defined conditions.
- Screening: Produces quantitative imaging readouts (stacking vs. non-stacking) that can be scored for compound effects on membrane binding.
- Analytics: Enables class averaging and 3D modeling of protein-nanodisc complexes to generate low-resolution structural data for target characterization.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical work by providing structural context for protein function in lipid environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing multiple peripheral membrane proteins across different lipid compositions and buffer conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Direct visualization of binding events and low-resolution structural insights reduce ambiguity in mechanistic models.
- Operational Value: Leverages widely available TEM equipment and standard negative staining protocols for broad accessibility.
- Strategic Value: Increases confidence in target engagement data, reducing failure rates in downstream structural and functional validation.
- Portfolio Impact: Enables early triage of targets based on confirmed membrane binding, improving capital efficiency in discovery pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, nanodisc reconstitution, and negative stain TEM sample preparation.
- Dependent on access to transmission electron microscopy and UV-Vis spectroscopy for nanodisc quantification.
- Necessitates optimization of lipid-to-scaffold ratios and buffer conditions for each protein-lipid system.
- Involves handling of air-sensitive lipids and phosphotungstate stain under controlled conditions.
- Limited to proteins that do not induce stacking themselves; binding is inferred from absence of stacks relative to controls.
