Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy
5 maart 2017
Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.
Het algemene doel van deze procedure is om de binding van een extrinsieke membraaneiwit op een nanodisc-membraanoppervlak te visualiseren door middel van negatieve kleuring met transmissie-elektronenmicroscopie als eerste stap naar hoge resolutie structuurbepaling van het eiwit. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in verschillende onderzoeksgebieden, omdat het gaat om eiwitactiviteiten die zich in en op cellulaire membranen voordoen. Het grote voordeel van deze techniek is de karakteristieke stapels van nanodisc-vormen als het eiwit zich niet aan de membranen kan binden.
Deze stapels zijn duidelijk zichtbaar door transmissie-elektronenmicroscopie. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot geneesmiddelontwikkeling, omdat verbindingen gemakkelijk kunnen worden getest op het vermogen om de membraaneiwitinteracties te blokkeren of mogelijk te maken. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de optimale omstandigheden voor monotope eiwitbinding aan uw membraan, biedt het ook een laag-resolutiestructuur van het eiwit-nanodisccomplex.
Om de procedure te starten, druk en zuiver membraanscaffolding-eiwit zoals MSP1E3D1 uit. Gebruik vervolgens een glazen spuit met een metalen naald om 305 microliter van 25 milligram per milliliter POPC in chloroform in een glazen ronde bodemfles te doseren. Laat het chloroform verdampen onder een zachte stroom stikstofgas in een afzuigkap.
Laat het resterende lipide een nacht drogen in een vacuümdesiccator. Los vervolgens het droge lipide-koekje op in 200 microliter MSP-standaardbuffer verrijkt met 100 millimolair natriumcholaat als detergent. Vortex de mengsel tot het transparant is om een suspensie van 50 millimolair POPC in buffer te verkrijgen.
Was vervolgens vijf gram hydrofobe kralen met 30 milliliter 100% methanol, vervolgens met 40 milliliter ultrapuur water en tenslotte met 10 milliliter MSP-standaardbuffer. Bewaar de kralen onder 15 milliliter standaardbuffer bij vier graden Celsius. Combineer vervolgens 190 microliter van een 0,124 millimolair oplossing van MSP1E3D1 en 61,5 microliter van een 50 millimolair suspensie van POPC in buffer, resulterend in een 1 tot 130 molair verhouding van MSP tot POPC en een natriumcholaatconcentratie van 25 millimolair.
De ideale verhouding van het lipide per MSP varieert met elke keuze van lipidetype en MSP-lens en moet worden geoptimaliseerd om een homogene bereiding van nanodiscs te verkrijgen. Incubeer het mengsel op nat ijs gedurende één uur. Voeg vervolgens de oplossing toe aan een buis met 0,5 gram gewassen hydrofobe bonen per milliliter van het reconstitutieve mengsel om nanodisczelfsamenstelling te initiëren.
Incubeer het mengsel bij vier graden Celsius gedurende 16 uur bij zeven tot acht rotaties per minuut. Laat na incubatie de kralen door zwaartekracht bezinken. Verwijder en bewaar het supernatant bij vier graden Celsius totdat het klaar is om grootte-exclusiechromatografie uit te voeren.
Voorafgaand aan grootte-exclusiechromatografie centrifugeer je het mengsel gedurende 10 minuten bij 13.000 g bij vier graden Celsius. Decanteer het supernatant en gooi de pellet weg. Equilibreer een grootte-exclusiechromatografiekolom met MSP-standaardbuffer totdat de basislijn bij 280 nanometer stabiel is.
Injecteer het supernatant in de kolom en verzamel het product in fracties van 0,5 milliliter. Meet de absorptie van de fracties bij 280 nanometer met een UV vis-spectrofotometer. Bereken de concentratie van nanodiscs met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt voor het gekozen MSP.
Om niet-denaturerende gelelektroforese uit te voeren, meng je eerst 15 microliter van het monster met vijf microliter van de juiste laadbuffer. Vul de kathodetank met licht kathodebuffer en de anodentank met runningbuffer. Laad het monster op een vier tot 16% Bis-Tris-gel en begin met de run.
Kleur de gel volgens de instructies van de gelfabrikant. Om de bereiding van een nanodisc-monotope-eiwitcomplex met vijf lipoxygenase als eiwit te beginnen, bereid je een batch MSP-standaardbuffer verrijkt met 1,5 millimolair calciumchloride. Druk het 5LO-eiwit uit en zuiver het.
Bereid onmiddellijk een 100 microliter mengsel van 0,8 micromolair 5LO en 0,8 micromolair nanodiscs in calciumverrijkte MSP-standaardbuffer. Ons voorbeeld van een monotope protease vijf lipoxygenase is afhankelijk van calcium-hoeveelheden om aan het membraan te binden. 5LO is zeer gevoelig en moet binnen een paar uur na bereiding worden gebruikt.
Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten op ijs. Bewaar het resulterende nanodisc-eiwitcomplexmonster bij vier graden Celsius gedurende maximaal één maand. Om de voorbereiding voor de TEM-analyse te beginnen, lost u één gram fosfowolfraamnatriumzout op in 50 milliliter ultrapuur water bij kamertemperatuur.
Pas de pH van de oplossing aan tot 7,4 met een 1-molare oplossing van natriumhydroxide. Filter de fosfowolfraamnatriumoplossing door een 0,22 micrometer spuitfilter en bewaar de oplossing bij kamertemperatuur. Maak vervolgens de oppervlakte van een 400-mazig koolstofcoating koperrooster hydrofiel door 20 seconden bij 30 milliampère te ontladen.
Plaats tussen 2,5 en vijf microliter van het nanodisc-monotope-eiwitcomplexmonster op het rooster en laat het monster 30 seconden rusten. Gebruik vervolgens filterpapier om overtollig oplossing van het rooster te deppen. Breng onmiddellijk een druppel fosfowolfraamnatriumoplossing aan en laat de oplossing 30 seconden rusten.
Druppel het overtollige oplossing af en laat het rooster aan de lucht drogen. Voer transmissie-elektronenmicroscopie uit met een versnelde spanning van 120 tot 200 kilovolt. Sluit afbeeldingen met lange stapels uit van verdere beeldverwerking.
Voor de geselecteerde afbeeldingen gebruikt u standaardverwerkingsmethoden om de klassegemiddelden te bepalen en om een laag-resolutie 3D-model van het nanodisc-monotope-eiwit te genereren. Met behulp van deze methode werden lege nanodiscs bereid met een 1 tot 130-verhouding van membraanscaffolding-eiwitten tot lipiden. Tijdens gro
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode om de binding van extrinsieke membraaneiwitten aan nanodisc-membranen te visualiseren met behulp van negatief gekleurde transmissie-elektronenmicroscopie. De techniek onthult hoe eiwitbinding de karakteristieke stapeling van nanodiscs kan voorkomen, wat inzicht geeft in eiwit-membraaninteracties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Structurele biologie
Achtergrond
- Extrinsieke eiwitten spelen een cruciale rol bij de functies van het cellulaire membraan.
- Transmissie-elektronenmicroscopie met negatieve kleuring is een waardevolle beeldvormingstechniek.
- Nanodiscs worden gebruikt als modelmembranen om eiwitinteracties te bestuderen.
- Inzicht in eiwitbinding is essentieel voor geneesmiddelenontwikkeling en structurele biologie.
Doel van de studie
- Om de binding van extrinsieke eiwitten op nanodiscmembranen te visualiseren.
- Om de implicaties van eiwitinteracties voor drug screening te onderzoeken.
- Om een structuur met lage resolutie van het eiwit-nanodisccomplex te verschaffen.
Gebruikte methoden
- Transmissie-elektronenmicroscopie met negatieve contrastering.
- Bereiding van nanodisc-membranen.
- Bindingsassays voor extrinsieke eiwitten.
- Analyse van nanodisc-stapelpatronen.
Belangrijkste resultaten
- De binding van extrinsieke eiwitten voorkomt de vorming van nanodisc-stapels.
- Karakteristieke stapelpatronen zijn zichtbaar wanneer eiwitten niet binden.
- De methode biedt inzicht in de optimale omstandigheden voor eiwitbinding.
- Potentiële toepassingen in de geneesmiddelenontwikkeling worden belicht.
Conclusies
- Deze techniek is effectief voor het bestuderen van interacties tussen eiwitten en membranen.
- Het biedt een weg naar structuurbepaling met een hoge resolutie.
- De bevindingen hebben implicaties voor het begrip van de functies van membraaneiwitten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de sector
Deze methode maakt de visualisatie van de binding van extrinsieke membraaneiwitten aan nanodiscs mogelijk via negative stain TEM, waarbij eiwitbinding de karakteristieke stapeling van nanodiscs voorkomt. Het biedt een snelle, lage-resolutie structurele readout om risico's bij de validatie van targets te verminderen en vroege drugscreening voor membraangeassocieerde eiwitten te informeren. De aanpak ondersteunt go/no-go-beslissingen door binding te bevestigen onder gedefinieerde lipide- en ionische condities, voordat er middelen worden toegewezen aan structureel werk met een hoge resolutie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Bevestigt de membraanbinding van extrinsieke eiwitten via directe visualisatie van geremde nanodisc-stapeling.
- Operationele waarde: Maakt een snelle beoordeling van eiwit-lipide-interacties mogelijk in een gecontroleerd membraan-mimetisch systeem.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt targetvalidatie door aan te tonen dat binding afhankelijk is van cofactoria zoals calciumionen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt screening mogelijk van verbindingen die de eiwit-membraanbinding moduleren door veranderingen in nanodisc-stapelingspatronen te meten.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van toegankelijke negatief-gekleurde TEM-infrastructuur voor contrastrijke beeldvorming zonder de vereisten van cryo-EM.
- Klaarheid voor assay: Genereert monsters die compatibel zijn met downstream structurele workflows, inclusief single-particle analyse en niet-denaturerende gels.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Biedt structurele inzichten met een lage resolutie die kunnen dienen als leidraad voor cryo-EM-studies met een hogere resolutie van eiwit-nanodisc-complexen.
- Mechanistische Risicoreductie: Verduidelijkt sterische en ruimtelijke beperkingen van eiwitbinding aan beide zijden van de nanodisc.
- Ziekterellevant Systeem: Modelleert interacties van perifere membraaneiwitten die relevant zijn voor signaleringspaden bij ontsteking en lipidemetabolisme.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische mechanistische studies en vormt een brug tussen biochemische bindingsassays en structuurbepaling met een hoge resolutie.
- Ontdekkingsbiologie: Test therapeutische hypothesen door te visualiseren of een eiwit bindt aan een membraanoppervlak onder gedefinieerde omstandigheden.
- Screening: Levert kwantitatieve imaging-resultaten op (stapeling versus geen stapeling) die kunnen worden gescoord op de effecten van verbindingen op membraanbinding.
- Analytiek: Maakt klassenmiddeling en 3D-modellering van eiwit-nanodisc-complexen mogelijk om lágresolutie structurele gegevens voor targetkarakterisering te genereren.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit naar preklinisch werk door structurele context te bieden voor de eiwitfunctie in lipidomgevingen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van meerdere perifere membraaneiwitten over verschillende lipidsamenstellingen en buffercondities.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Directe visualisatie van bindingsgebeurtenissen en structurele inzichten met lage resolutie verminderen de ambiguïteit in mechanistische modellen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van breed beschikbare TEM-apparatuur en standaard protocollen voor negatieve kleuring voor een brede toegankelijkheid.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in gegevens over target-engagement, waardoor faalkansen bij downstream structurele en functionele validatie worden verlaagd.
- Impact op portfolio: Maakt vroege triage van targets mogelijk op basis van bevestigde membraanbinding, wat de kapitaalefficiëntie in discovery-pipelines verbetert.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in eiwitexpressie, nanodisc-reconstitutie en de preparatie van monsters voor negatief gekleurde TEM.
- Afhankelijk van toegang tot transmissie-elektronenmicroscopie en UV-Vis-spectroscopie voor de kwantificering van nanodiscs.
- Vereist optimalisatie van de lipide-scaffold-verhoudingen en buffercondities voor elk eiwit-lipidesysteem.
- Omvat het hanteren van luchtgevoelige lipiden en fosfotungstaatkleuring onder gecontroleerde omstandigheden.
- Beperkt tot eiwitten die zelf geen stapeling induceren; binding wordt afgeleid uit de afwezigheid van stapels ten opzichte van controles.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Preparation, Reconstitution, and Analysis of Empty Nanodiscs
5:11
Preparation and Analysis of the Nanodisc-Monotopic Protein Complex
7:56
Results: Monotopic Membrane Protein Binding on the Surfaces of Empty Nanodiscs (NDs)
9:26
Conclusion
