Name: Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Leer hoe je de binding van extrinsieke membraaneiwitten op nanodiscs visualiseert met negatieve kleuring transmissie-elektronenmicroscopie. Deze methode onthult eiwit-membraaninteracties en biedt inzichten voor structurele biologie en medicijnontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de Zweedse Research Council, Stockholm County Council, en KI fondsen voor hun steun. De expressie en zuivering van MSP werd uitgevoerd bij het Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Science Core Facility (http://PSF.ki.se). De auteurs willen ook graag bedanken Dr. Pasi Purhonen en Dr. Mathilda Sjöberg voor het delen van hun technische expertise en voor de tijdige hulp.

1. Bereiding van nanodiscs <ol><li> Expressie en zuivering van het membraan eiwit steigers 8, 35 <ol><li> De His-tag MSP1E3D1 in de E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 stam in kolven te uiten. Bereid een 50 ml overnacht starterkweek met LB medium aangevuld met 50 ug / ml kanamycine bij 37 ° C. Verdun de nacht startercultuur in 2 L van geweldige kweekmedium gesupplementeerd met 50 ug / ml kanamycine. </li><li> Groeien de cellen bij 37 ° C totdat de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) er ongeveer 3. induceren de eiwitexpressie met 0,5 mM isopropyl-β-D-1 (IPTG) gedurende 3 uur bij 18 ° C. </li><li> Bereid de lysisbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl en 10% glycerol). Voeg 1 mM TCEP onmiddellijk voor gebruik. </li><li> Na 3 uur van inductie bij 18 ° C, verzamel de cellen door centrifugatie gedurende 10 min bij 4500 xgen 4 ° C. Verwijder het supernatant, wegen de geoogste cellen en hersuspenderen ze in lysisbuffer in een verhouding van 2 ml lysisbuffer per gram cellen. </li><li> Lyse van de cellen door gepulste geluidsgolven (herhalingsfrequentie: 4 s ON, 4 s OFF) gedurende 3 minuten bij 80% amplitude. </li><li> Centrifugeer de lysaten gedurende 20 minuten bij 49.000 xg en 4 ° C. Gooi de pellet uit deze centrifugatie. </li><li> Injecteer de supernatant in een 5 ml Ni + chelerende kolom verbonden met een geautomatiseerd Vloeistofchromatografiesysteem voorkeur bewaard bij 4 ° C. </li><li> Voordat de elutie (stap 1.1.9), was de kolom met buffers 1 - onder de 3 om alle eiwitten te verwijderen met uitzondering van de His-tag MSP. Monitor het eiwitgehalte bij 280 nm om de zuivering te volgen; de UV-opname bij 280 nm moet terug naar de baseline gaan na elke wasbeurt. <ol><li> Wassen met wasbuffer 1: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, en 1% Triton, pH 8,0. </li><li> Wassen met wasbuffer 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMNaCl, 20 mM imidazool en 50 mM natriumcholaat, pH 8,0. </li><li> Wassen met wasbuffer 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl en 50 mM imidazool, pH 8,0. </li></ol></li><li> Elueer het MSP met 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCI en 500 mM imidazol, pH 8,0. </li><li> Verander de buffer standaard buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl en 0,5 mM EDTA) MSP met gelfiltratie 8, 35; de opbrengst per batch duurt ongeveer 7 mg L -1. </li></ol></li><li> Bereiding van fosfolipiden stockoplossing <ol><li> Voeg 305 ul van 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC) opgelost in chloroform bij een concentratie van 25 mg / mL aan een glazen beker en verdampen van het chloroform door spoelen met een zachte stikstofstroom . Droog het lipide overnacht in een vacuümexsiccator. Opmerking: Deze stap wordt uitgevoerd om het oplosmiddel uit het lipide, dat een dunne film van lipide bladeren onderaan een bekerglas verwijderd.</li><li> Resuspendeer het lipide cake in 200 pl MSP standaard buffer die 100 mM natriumcholaat door vortexen de buis tot de oplossing transparant; Dit zal een oplossing met een POPC concentratie van 50 mM te verschaffen. OPMERKING: 2 (lipide: detergent) 8 In het algemeen is de molaire verhouding van lipide detergentia op dit moment moet 1 zijn. Deze lipide-detergens mengsel kan bijna 2 maanden worden bewaard bij -80 ° C. </li></ol></li><li> Bereiding van hydrofobe kralen voor detergensverwijdering <ol><li> Plaats 5 g kralen (droog gewicht) in een 50 ml buis. </li><li> Was de kralen met 30 ml 100% methanol en vervolgens met 40 ml ultrazuiver water. </li><li> Was de kralen met 10 ml MSP standaard buffer. Tenslotte worden opgeslagen kralen met 15 ml MSP standaard buffer bij 4 ° C. </li></ol></li><li> nanodisc reconstructie <ol><li> Doseer 190 ul van MSP1E3D1 (0,124 mm) in een microfugebuis en voeg 61,5 ul van fosfolipiden voorraad-oplossing (50 mM POPC) dezelfde buis. Incubeer de reconstitutie mengsel op nat ijs gedurende 1 uur. LET OP: Dit komt overeen met een molaire verhouding van 1: 130 (MSP1E3D1: POPC). </li><li> Voeg hydrofobe kralen aan een concentratie van 0,5 g korrels per ml reconstitutie mengsel aan de zelfassemblage te starten. Incubeer in een roterende incubator gedurende 16 uur bij 4 ° C. </li><li> Na incubatie, centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 xg en 4 ° C om de precipitaten en aggregaten te verwijderen. Gooi de pellet en sla het supernatant. </li><li> Equilibreren de size exclusion chromatografie kolom (gemonteerd op een geautomatiseerd Vloeistofchromatografiesysteem) met MSP standaard buffer totdat de absorptie bij 280 nm stabiel. Spuit de bovenstaande vloeistof in de kolom en het verzamelen van de piek fracties. </li><li> Meet de concentratie van nanodiscs in de piekfracties bij 280 nm. Gebruik de molaire extinctiecoëfficiënt van MSP1E3D1 (ε = 29.910 cm -1 -1 M) voor het berekenen van de concentratie nanodisc. Merk opaantal lipiden per nanodisc kan worden gemeten door een combinatie van radioactief gemerkte lipiden en fosfaatanalyse 4 of fosfaatanalyse alleen. </li></ol></li></ol> 2. Bereiding van de Monotopic Protein 5-Lipoxygenase 35 <ol><li> Bereid een overnachting starter cultuur. Supplement 50 ml LB medium met 100 ug / ml ampicilline. Beënten medium met E. coli BL21 (DE3) die het plasmide van de 5-lipoxygenase gen (ALOX5). Verdun de nacht startercultuur in expressie medium dat 42 mM Na 2 HPO 4, 24 mM KH 2PO 4, 9 mM NaCl, 19 mM NH4 Cl, 1 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, 0,2% D-glucose, 0,1 %, 5 pM FeSO 4 en 100 gg / ml ampicilline. Groeien de cellen tot de OD 600 is ~ 0,5 bij 25 ° C. Induceren van eiwitexpressie met 0,2 mM IPTG gedurende 16 uur bij 20 ° C 35. </li><li> Oogst door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 7000 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant. Weeg de pellet onderaan van de buis met het geoogste cellen en resuspendeer de geoogste cellen in lysisbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glycerol en 1 mM TCEP) met proteaseremmer en 0,5 mg / ml lysozym 35 in een verhouding van 2 ml lysisbuffer per gram cellen. </li><li> Lyseren de cellen door sonicatie gedurende 5 x 15 s bij 80% amplitude. Verwijder de celresten door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 7000 xg en 4 ° C. Voer ammoniumsulfaatprecipitatie tot 30-60% verzadiging om de eiwitten neer te slaan in de oplossing 35. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 16.000 xg en 4 ° C. OPMERKING: De 5LO korrel kan snel worden ingevroren en opgeslagen bij -80 ° C maximaal 6 maanden. </li><li> Resuspendeer de pellet met 20 ml lysisbuffer en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 40.000 xg en 4 ° C. </li><li> Incubeer de supernatant op<html> een ATP-agarose-kolom bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was de kolom eenmaal met één kolom volume lysis buffer die 0,5 M NaCl. Elueer het 5LO met 20 mM ATP in lysis buffer die 10 uM FeSO 4 en 20 ug / ml catalase. Voer gelfiltratiechromatografie de ATP 35 verwijderen. NB: De 5LO is instabiel en moet onmiddellijk worden gebruikt na zuivering. Anders is het raadzaam om te stoppen bij de stap van het ammoniumsulfaat neerslag (zie de opmerking na stap 2.1.3). </li></ol> 3. Bereiding van de nanodisc-eiwit Complex <ol><li> Bereid een totaal volume van 100 ui complex. Meng 0,8 uM en 0,8 uM ND 5LO met 1 mM Ca2 + in de MSP standaard buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA en 1,5 mM CaCl2) en incubeer gedurende 10 min op ijs. Opmerking: Het monster kan worden opgeslagen gedurende één maand bij 4 ° C 35. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 4. Analyse van de monsters <ol><li> gelelektroforese <ol><li> Niet-denaturerende elektroforese <ol><li> Mix 15 pi van het monster met 5 gl laadbuffer (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w / v) glycerol en 0,001% Ponceau S, pH 7,2) 49 en laad een 4 - 16% Bis-Tris gel aan elektroforese voeren. </li><li> Vul de kathode tank met licht kathode buffer (50 mM Bis Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8 en 0,002% Coomassie G-250) en de anode tank met loopbuffer (50 mM Bis Tris en 50 mM Tricine, pH 6,8). Start de scheiding met behulp van een constante spanning bij 150 V. </li><li> Stop de elektroforetische scheiding wanneer de Coomassie achterkant einde van de gel bereikt. </li><li> Vlekken op de gel met een standaard Coomassie blauw protocol. </li></ol></li><li> denaturerende elektroforese <ol><li> Meng 40 pl monster met 10 gl laadbuffer bevattende SDS (0,05% (w / v) broomfenolblauw; 0,2 M Tris-HCl,pH 6,8; 20% (v / v) glycerol; 10% (w / v) SDS; en 10 mM 2-mercaptoethanol) en plaats het op een 4-20% Tris-glycine gel elektroforese voeren. </li><li> Vul de kathode en anode tanks met loopbuffer (25 mM Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM glycine en 0,1% (w / v) SDS). Start de scheiding met behulp van een constante spanning bij 150 V. </li><li> Stop de elektroforetische scheiding wanneer het laden kleurstof achterkant einde van de gel bereikt. </li><li> Vlekken op de gel met een standaard Coomassie blauw protocol. </li></ol></li></ol></li><li> Voorbereiding van de NAPT oplossing <ol><li> Los 1 g fosfowolframaat natriumzout in 50 ml water door roeren bij kamertemperatuur tot een 2% (w / v) zure oplossing. </li><li> Breng de pH op 7,4 met 1 M NaOH. Verwijder de deeltjes onder toepassing van een 0,22 urn spuitfilter. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur of bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Voorbereiding van het monster voor TEM analyse <ol><li> Glow-ontlading koolstof beklede koperen roosters (400 mesh) gedurende 20 s bij 30 mA tot de netwerken hydrofiele vóór de adsorptie van het monster maken. Plaats 3,5 pi van het monster (0,8 uM opzichte van de nanodiscs) op het net en incubeer gedurende 30 s. OPMERKING: De toegepaste hoeveelheid kan variëren tussen 2,5 en 5 pl, afhankelijk van de monsterconcentratie. Een geschikt concentratiegebied voor nanodiscs is 0,5-1 uM. </li><li> Blot off overtollige oplossing met behulp van papieren filter. </li><li> Onmiddellijk vlek het raster met een druppel van 2% NAPT gedurende 30 s. Dep het overtollige oplossing en laat het rooster aan de lucht drogen. </li><li> Evalueer de roosters met TEM. Een microscoop met 120-200 keV versnellende spanning is voldoende om een ​​schatting van de omvang van het stapelen. LET OP: Voor het huidige protocol, werd een geijkt transmissie-elektronenmicroscoop gebruikt, uitgerust met een 200-keV veldemissie pistool. </li><li> Noteer de TEM beelden. Voor de beelden die lange stapels, niet verder te verwerken; beelden tonen het complex van nanodiscs met extrinsieke eiwit dat een paar bevattenshortstacks, maar de meeste deeltjes in het complex. Opnemen verschillende beelden en deze werkwijze volgens standaardmethoden klasse-gemiddelden en een lage resolutie, 3 dimensionaal model van het complex te verkrijgen. LET OP: Voor het verzamelen van negatieve vlek data, werden roosters op minstens drie verschillende dagen. Voor elke dag, werden vers monster incubaties (zoals in stap 3.1) vóór de negatieve vlek werd toegepast. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De werkwijze kan worden onderverdeeld in drie delen: de reconstructie van lege nanodiscs, de bereiding van eiwit-complexen nanodisc en de negatieve kleuring voor de TEM van deze complexen. Elk onderdeel zal afzonderlijk worden behandeld met betrekking tot beperkingen van de techniek, kritische stappen en nuttige wijzigingen. Reconstructie van lege nanodiscs. Kritische stappen en beperkingen in de productie en het gebruik van nanodiscs. Voor de bereiding van de lege ...

In medisch onderzoek wordt veel aandacht besteed aan membraaneiwitten, intrinsiek of extrinsiek betrokken bij diverse lipide interacties. Werken met lipide-interagerende eiwitten omvat hetzij het selecteren van een alternatief voor de lipiden, zoals detergenten, amphipols 1 of 2 kleine eiwitten, of het vinden van een alternatief membraan dat het eiwit oplosbaar en actief houdt. Lipoic membraan substituten omvatten liposomen en nanodiscs (ND) 3, 4. Nanodiscs zijn near-native membraan platforms ontwikkeld door engineering van het eiwit gedeelte, ApoA-1, van de high-density lipoproteïne (HDL) die van nature in het bloed. ApoA-1 is een 243 residu-lange keten korte amfipathische α-helices en een lipide-oplosbaar vrij conformatie. In vitro als in aanwezigheid van lipiden, twee kopieën van het eiwit ApoA-1 spontaan herschikken de hydr omcirkelenophobic acylketen gedeelte van een lipide bilaag patch 5. Gemanipuleerde versies van ApoA-1 worden over het algemeen genoemd membraan scaffolding eiwitten (MSP) en steeds zijn in de handel verkrijgbaar als plasmiden of gezuiverde eiwitten. Herhalingen of deleties van de α-helices in ApoA-1 resulteren in een langere of kortere 6 7 membraan steigers eiwitten. Dit maakt het weer mogelijk om schijven te vormen ongeveer 6 nm 7-17 nm 8 in diameter. Er zijn verschillende soorten van de aanvragen voor de nanodiscs 3, 9. De meest gebruikte toepassing is het een bijna-natieve membraan omgeving voor het stabiliseren van een integraal membraaneiwit 8, voorheen 3, 9 beoordeeld verschaffen. Een minder onderzocht gebruik een nanoschaal membraanoppervlak te verschaffen voor de studie vanperifere membraaneiwitten 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Deel 1 van het protocol hieronder visualiseert de procedure voor het maken van nanodiscs samengesteld uit fosfolipiden en membraan steigers eiwit. Monstervoorbereiding is een knelpunt in de meeste methoden. Methode-specifieke monsters kunnen bepaalde informatie toe te voegen, maar ze ook vergelijkingen van de resultaten bemoeilijken. Daarom is het eenvoudiger wanneer monsters multimodale en kan direct worden gebruikt in verschillende methoden. Een voordeel van het gebruik van nanodiscs is de geringe omvang van de nanodisc vergeleken met liposomen (bijvoorbeeld kunnen de monsters direct worden gebruikt voor zowel TEM en niet-denaturerende gelelektroforese, zoals in het onderhavige protocol). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; blaasjes en liposomen zijn lang gebruikt om de functie van membraan- interagerende eiwitten te begrijpen. Structurele studies en visualisatie, een voorbeeld van de structuurbepaling van een transmembraaneiwit in liposomen beschikbaar 18. Echter geen hoge-resolutie 3D-structuur van een monotopic membraaneiwit ingesloten in een liposoom membraan nog niet gepubliceerd, voor zover wij weten. Goud nanodeeltjes of antilichamen kunnen worden gebruikt om eiwitten binden aan liposomen of blaasjes via TEM 19 visualiseren. Hoewel deze probes zeer specifiek zijn, kunnen ze interfereren met membraan-bindende eiwitten door veiling het membraan bindingsplaats of maskeren gebieden van belang met de flexibele onderdelen. Goud-gemerkte antilichaam gecomplexeerd of eiwitten kan waarschijnlijk worden geanalyseerd op een gel, maar dit zou de kosten van het experiment te verhogen. Hoewel liposomen zijn een uitstekend platform, kan men niet zeker dat de pop te zijnning een bepaalde verhouding eiwit per liposoom, een eigenschap die kan worden onderzocht door het gebruik van nanodiscs 20. In een liposoom, kan cofactoren en substraten worden gevangen in de oplosbare interieur. Stoffen die oplosbaar membraan zal hetzelfde lot beide typen membraan mimetica delen. Daar de bilaag kleiner is in nanodiscs, een kleinere hoeveelheid stof nodig is om de membranen nanodisc verzadigen. Begrip eiwitfunctie door het bepalen van de atomaire structuur is essentieel geweest voor vele vakgebieden. Methoden voor eiwitstructuur bepaling onder X-ray 21; kernmagnetische resonantie (NMR) 22, 23; en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) 24 bij cryogene temperaturen, cryoEM. De resolutie van cryoEM is de laatste tijd sterk verbeterd, voornamelijk als gevolg van het gebruik van directe electron detectors 25, 26. De macromoleculen worden afgebeeld in dunne, glasvocht ijs 27 in een near-native staat. Vanwege het lage contrast van biologische moleculen, worden ze moeilijk te detecteren met afmetingen van 100-200 kDa. Voor voldoende grote monsters kan gegevensverzameling gedaan en de methode van afzonderlijke deeltjes reconstructie kan worden toegepast op een structuur 28 te verkrijgen. De bepaling van de eiwitstructuur door TEM is een meerdere stappen. Het begint meestal met de evaluatie van monster monodispersiteit door negatieve vlek TEM 29 met behulp van zouten van zware metalen zoals phosphotungsten (PT) 30 of 31 uranium. Reconstructie van een lage resolutie model van de negatief gekleurde macromolecuul wordt meestal gemaakt en kunnen belangrijke informatie opleveren over de moleculaire structuur 29. Tegelijkertijdhet verzamelen van gegevens met behulp van cryoEM kan beginnen. Voorzichtigheid is geboden bij de beoordeling van negatieve vlek TEM gegevens naar de verkeerde interpretatie van artefact vorming te voorkomen. Eén specifiek artefact is het effect van de PT vlek op fosfolipiden en liposomen 32, resulterend in de vorming van lange staven gelijkend stapels muntstukken van de zijkant 33. Dergelijke &quot;rouleau&quot; of &quot;stacks&quot; (hierna aangeduid als &quot;stacks&quot;) werden vroeg waargenomen voor HDL 34, en later ook nanodiscs 35. Het stapelen en herziening van membranen kunnen optreden om vele redenen. Zo kan worden geïnduceerd door co-factoren zoals koper, getoond door TEM beeldvorming in een ammoniummolybdaat vlek 36. Een fractie van de membraanlipiden in liposomen bevatte een iminodiazijnzuur kopgroep nabootsen metaal complexatie met EDTA, waardoor stapelen liposomen na de toevoeging van koperionen 37. De vorming stack van fosfolipiden door PT werd al vroeg waargenomen; echter, heeft later werkzaamheden gericht op het verwijderen of afschaffing van deze formatie artefact 38. Hier stellen we een werkwijze om te profiteren van de NAPT-geïnduceerde nanodisc stapelen voor de studie van membraan-bindende eiwitten door TEM. In het kort, zou eiwit bindend voor de nanodiscs voorkomen dat de nanodiscs van het stapelen. Hoewel de redenen voor het stapelen niet duidelijk is voorgesteld 39 dat er een elektrostatische interactie tussen de fosfolipiden en de fosforylgroep van PT, waardoor de schijven aan elkaar kleven (Figuur 1A). De hypothese achter ons protocol is dat wanneer een eiwit bindt aan een nanodisc meeste fosfolipidenoppervlak niet beschik<html> woordelijk voor de interactie met de PT als gevolg van sterische hindering door het eiwit. Dit zou stack vorming (figuur 1B) te voorkomen. kunnen twee conclusies worden getrokken. Ten eerste, het voorkomen van stapeling betekent dat het eiwit van belang gebonden is aan het membraan. Ten tweede kan het eiwit-ND complex worden behandeld met standaard single-deeltje verwerkingsmethoden 24, 40 een ruwe morfologie van het complex te krijgen. Bovendien analyseert door methoden zoals niet-denaturerende gelelektroforese of dynamische lichtverstrooiing kan worden uitgevoerd. Om deze hypothese te tonen gebruikten we de membraan bindingseiwit 5-lipoxygenase (5LO), dat betrokken is bij vele ontstekingsziekten 41, 42. Het 78-kDa eiwit vereist calciumionen te binden aan het membraan 43. Hoewel dit membraan vereniging is onderzocht veelvuldig gebruik van liposomens = &quot;xref&quot;&gt; 44, 45, 46 en membraanfracties 47, deze kan niet worden gebruikt voor TEM analyse en structuurbepaling. De bereiding van nanodiscs begint door het mengen van MSP met lipide gesuspendeerd in het wasmiddel natriumcholaat. Na incubatie op ijs gedurende 1 uur, wordt het detergens langzaam uit de reconstitutie mengsel met een adsorbens hars. Dit soort materiaal wordt vaak gemaakt van polystyreen gevormd tot kleine kralen. Ze zijn relatief hydrofoob en hebben een sterke voorkeur voor binding detergent ten opzichte van lipiden 48. Na verwijdering van het hydrofobe kralen en uitvoeren klaring door middel van centrifugatie worden de nanodiscs gezuiverd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). De gezuiverde nanodiscs worden gemengd met een monotopic membraaneiwit (en eventuele cofactoren) in een equimolaire ratio (ratio of meerdere voor een titratie) en worden overgelaten aan rEACT (15 min). Analyse door TEM wordt uitgevoerd door het toepassen van ul-hoeveelheden van het monster op glow-ontladen, koolstof beklede roosters en vervolgens door het uitvoeren van negatieve kleuring met NAPT uitgevoerd. Hetzelfde monster uit als de hoeveelheden werden toegepast op de TEM roosters kan worden gebruikt voor analyse door niet-denaturerende of SDS PAGE-gel-elektroforese, en door verschillende soorten activiteitsmetingen, zonder grote veranderingen.

<table><tbody><tr><td>Transmission electron microscope: JEOL2100F</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glow discharger</td><td>Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM grid: 400 mesh</td><td>TAAB</td><td>GM016/C</td><td></td></tr><tr><td>Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid: MSP1E3D1</td><td>Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria: BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>Protein Science Facility, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purification Matrix: ATP agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipid: POPC</td><td>Avanti polar lipids</td><td>850457C</td><td>25 mg/mL in chloroform</td></tr><tr><td>Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>13 mm syringe filter: 0.2 &mu;m</td><td>Pall life sciences</td><td>PN 4554T</td><td></td></tr><tr><td>Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Detergent: Sodium cholate hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cholate</td><td></td><td></td><td>500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Lipid Stock</td><td></td><td></td><td>50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. <bt />Store at 4 &deg;C for a week; or Store -80 &deg;C for a month, after purging the solution with nitrogen.</td></tr><tr><td>MSP standard buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA. Store at 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2001</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8</td></tr><tr><td>Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2002</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250</td></tr><tr><td>Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2003</td><td>50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S</td></tr><tr><td>Denaturaing Electrophoresis Running Buffer</td><td></td><td></td><td>In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS</td></tr><tr><td>Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer</td><td></td><td></td><td>In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol</td></tr><tr><td>Terrific broth</td><td></td><td></td><td>Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL. Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.</td></tr></tbody></table>

methode om te visualiseren en te analyseren membrane interagerende eiwitten door transmission electron microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotope eiwitten oefenen hun functie uit wanneer ze aan een membraanoppervlak zijn bevestigd, en dergelijke interacties zijn afhankelijk van de specifieke lipidensamenstelling en op de beschikbaarheid van voldoende oppervlakte om de functie uit te voeren. Nanodiscs worden gebruikt om een membraanoppervlak met gecontroleerde grootte en lipidegehalte te bieden. Bij afwezigheid van gebonden extrinsieke eiwitten zien natriumfosfowolframaat-gekleurde nanodiscs eruit als stapels munten wanneer ze van de zijkant worden bekeken door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Dit protocol is daarom ontworpen om het stapelen bewust te bevorderen; bijgevolg kan het voorkomen van stapeling worden geïnterpreteerd als de binding van het membraanbindende eiwit aan de nanodisc. In een verdere stap kunnen de TEM-beelden van de eiwit-nanodisc complexen worden verwerkt met standaard single-particle methoden om lagere resolutiestructuren te verkrijgen als basis voor hogere resolutie cryoEM-werk. Verder bieden de nanodiscs monsters die geschikt zijn voor TEM of niet-denaturerende gelelektroforese. Om de methode te illustreren, wordt Ca2+-geïnduceerde binding van 5-lipoxygenase op nanodiscs gepresenteerd.

De werkwijze die we voorstellen is afhankelijk van de opstelling van nanodiscs op het membraanoppervlak voor monotopic membraan-eiwitbinding verschaffen. Aangezien er geen transmembraaneiwit ingebed in de nanodisc lipide bilaag, worden de nanodiscs hier aangeduid als &quot;lege nanodiscs&quot; (Figuur 2A). Deze hebben een berekend molecuulgewicht van 256 kDa voor een samenstelling van twee MSP1E3D1 steigers eiwitten en ongeveer 260 moleculen van POPC 8....

Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Het algemene doel van deze procedure is om de binding van een extrinsiek membraaneiwit op het oppervlak van een nanodisc-membraan te visualiseren via negatief gekleurde transmissie-elektronenmicroscopie, als eerste stap richting de bepaling van de eiwitstructuur met hoge resolutie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in verschillende onderzoeksgebieden, aangezien het betrekking heeft op eiwitactiviteiten die plaatsvinden in en op cellulaire membranen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de vorming van karakteristieke stapels nanodiscs indien het eiwit niet aan de membranen kan binden.Deze stapels zijn duidelijk zichtbaar via transmissie-elektronenmicroscopie. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de ontwikkeling van geneesmiddelen, aangezien verbindingen eenvoudig gescreend kunnen worden op hun vermogen om membraaneiwitinteracties te blokkeren of mogelijk te maken. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de optimale omstandigheden voor monotopische eiwitbinding aan uw membraan, biedt het ook een structuur met lage resolutie van het eiwit-nanodisccomplex.Om met de procedure te beginnen, dient een membraansteunprotein zoals MSP1E3D1 te worden tot expressie gebracht en gezuiverd. Dispenseer vervolgens met een glazen spuit met een metalen naald 305 µL van 25 mg/mL POPC in chloroform in een glazen rondbodemkolf. Laat het chloroform verdampen onder een zachte stroom nitrogengas in een zuurkast.Droog het resterende lipide overnight in een vacuüm-desiccator. Los vervolgens de gedroogde lipidcake op in 200 µL MSP-standaardbuffer, verrijkt met 100 mM natriumcholaat als detergent. Vortex het mengsel tot het transparant is om een suspensie van 50 mM POPC in buffer te verkrijgen.Was vervolgens vijf gram hydrofobe beads met 30 milliliter 100% methanol, daarna met 40 milliliter ultrapuur water en tenslotte met 10 milliliter MSP-standaardbuffer. Bewaar de beads in 15 milliliter standaardbuffer bij vier graden Celsius. Combineer vervolgens 190 microliter van een 0,124 millimolaire oplossing van MSP1E3D1 met 61,5 microliter van een 50 millimolaire suspensie van POPC in buffer, resulterend in een molaire ratio van één op 130 voor MSP ten opzichte van POPC en een natriumcholaatconcentratie van 25 millimolair.De ideale ratio van het lipide per MSP varieert per keuze van lipidetype en MSP-lens en moet worden geoptimaliseerd om een homogene preparatie van nanodiscs te verkrijgen. Incubeer het mengsel gedurende één uur op nat ijs. Voeg vervolgens de oplossing toe aan een buis met 0,5 gram gewassen hydrofobe kralen per milliliter reconstitutiemengsel om de zelfassemblage van nanodiscs te initiëren.Incubeer het mengsel 16 uur bij 4 °C bij zeven tot acht omwentelingen per minuut. Laat na incubatie de beads bezinken door zwaartekracht. Verwijder het supernatant en bewaar dit bij 4 °C tot het tijd is om de grootte-uitsluitingschromatografie uit te voeren.Centrifugeer het mengsel vóór de grootte-uitsluitingschromatografie 10 minuten lang bij 13 000 g bij vier graden Celsius. Giet de supernatant af en gooi het pellet weg. Equilibreer een grootte-uitsluitingschromatografiekolom met MSP-standaardbuffer totdat de basislijn bij 280 nanometer stabiel is.Injecteer het supernatant op de kolom en verzamel het product in fracties van 0,5 milliliter. Meet de absorptie van de fracties bij 280 nanometer met een UV-vis-spectrofotometer. Bereken de concentratie van de nanodiscs met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt voor de gekozen MSP.Om niet-denaturerende gelelektroforese uit te voeren, mengt u eerst 15 µL van het monster met vijf µL van de juiste laadbuffer. Vul het kathodereservoir met lichte kathodebuffer en het anodereservoir met loopbuffer. Laad het monster op een 4 tot 16% Bis-Tris gel en start de run.Kleur de gel volgens de instructies van de gel-fabrikant. Om te beginnen met de preparatie van een nanodisc monotopisch proteïnecomplex met vijf lipoxygenase als het eiwit, bereid een batch MSP-standaardbuffer voor verrijkt met 1,5 millimolar calciumchloride. Exprimeer en zuiver het 5LO-eiwit.Bereid onmiddellijk een mengsel van 100 µL bestaande uit 0,8 µM 5LO en 0,8 µM nanodiscs in calcium-verrijkte MSP-standaardbuffer. Ons voorbeeld van een monotopisch proteinase vijf lipoxygenase is afhankelijk van de calciumhoeveelheden om aan het membraan te binden. 5LO is zeer gevoelig en moet binnen enkele uren na bereiding worden gebruikt.Incubeer het mengsel 10 minuten op ijs. Bewaar het resulterende nanodisc-eiwitcomplexmonster bij vier graden Celsius gedurende maximaal één maand. Om de voorbereiding voor de TEM-analyse te starten, los je één gram natriumfosfotungstaat op in 50 milliliter ultrapuur water bij kamertemperatuur.Stel de pH van de oplossing bij naar 7,4 met een een molaire oplossing van natriumhydroxide. Filtreer de natriumfosfotungstaat-oplossing door een 0,22 micrometer spuitfilter en bewaar de oplossing bij kamertemperatuur. Pas vervolgens gedurende 20 seconden een glow-discharge toe op een 400 mesh koolstofgecoat kopergrid bij 30 milliampère om het grid-oppervlak hydrofiel te maken.Breng tussen de 2,5 en vijf µL van het nanodisc monotopic proteïnecomplex-monster aan op het grid en laat het monster 30 seconden inwerken. Gebruik vervolgens filterpapier om het overtollige oplosmiddel van het grid te blotten. Breng onmiddellijk een druppel natriumfosfotungstaat-oplossing aan en laat de oplossing 30 seconden inwerken.Dep de overtollige oplossing en laat het raster aan de lucht drogen. Voer transmissie-elektronenmicroscopie uit met een versnellingsspanning van 120 tot 200 kilovolt. Sluit beelden met lange stapels uit van de daaropvolgende beeldverwerking.Gebruik voor de geselecteerde beelden standaard verwerkingsmethoden om de klasse-gemiddelden te bepalen en om een 3D-model met lage resolutie van het monotopische nanodisc-eiwit te genereren. Met deze methode werden lege nanodiscs geprepareerd met een verhouding van 1 op 130 tussen membraanstut-eiwitten en lipiden. Tijdens size-exclusion chromatografie werd slechts één belangrijke piek waargenomen en bij blue native gel-elektroforese werd slechts één band waargenomen.Wanneer de lege nanodiscs worden behandeld met een fosfotungstaat-natriumzoutoplossing, wordt stapeling geïnduceerd. Deze lange stapels kunnen vervolgens met TEM worden waargenomen. Deze stapeling werd niet verstoord door de toevoeging van calciumionen aan de nanodisc-oplossing vóór het aanbrengen van de fosfotungstaat-natriumoplossing.Wanneer een monotopisch eiwit, zoals 5-lipoxygenase, is gebonden aan het oppervlak van de nanodisc, wordt stapeling belemmerd door sterische hinder van het eiwit. Beide zijden van de nanodisc zijn beschikbaar voor binding, waardoor de vorming van één-op-één en twee-op-één 5LO-nanodisccomplexen mogelijk is. Het monster van twee-op-één 5LO-nanodisccomplexen vertoonde minder stapeling dan het één-op-één monster.De binding van 5LO vereist de aanwezigheid van calciumionen. Dit werd bevestigd door de waarneming van stapeling in een mengsel van 5LO en nanodiscs zonder calcium, wat aangaf dat 5LO niet aan de membraanoppervlakken was gebonden. Zodra het monotope eiwit en de nanodiscs zijn voorbereid, kan de evaluatie van de eiwitbinding aan uw membraan in een middag worden voltooid, mits dit correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het oppervlak van het eiwit op de nanodisc te schatten om de juiste MSP-lengte te kiezen. Bij goed passende formaten kunnen maximaal twee extrinsieke eiwitten binden, één aan elke zijde van de disc. Het is daarnaast belangrijk dat het natriumzout van fosforwolfraam wordt gebruikt voor de negatieve contrastvloeistof om maximale stapeling te waarborgen, aangezien binding wordt bevestigd door de afwezigheid van stapels te vergelijken met de lange stapels van een monster zonder monotopisch eiwit.Het gebruik van nanodiscs in plaats van liposomen maakt het mogelijk om dynamische lichtverstrooiing en klein-hoek röntgenverstrooiing in te zetten om aanvullende vragen over de homogeniteit, grootte of moleculaire structuur van het monster te beantwoorden. De laag-resolutie 3D-structuur van een monotopisch membraaneiwit gebonden aan een nanodisc zou een gemakkelijk toegankelijke eerste stap kunnen zijn op weg naar de hoog-resolutie structuur van deze gebonden eiwitten.

method-to-visualize-analyze-membrane-interacting-proteins

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We beschrijven een methode die de kinetiek van ionen transport van membraaneiwitten maatregelen naast locatie-specifieke analyse van conformationele veranderingen met behulp van fluorescentie op enkele cellen. Deze techniek is aanpasbaar aan ionkanalen, transporteurs en ion pompen en kan worden gebruikt om de afstand tussen de beperkingen eiwitsubeenheden te bepalen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

We presenteren een protocol over hoe om te verzamelen en te verwerken elektronen cryo-tomogrammen van hele mitochondriën. De techniek biedt gedetailleerd inzicht in de structuur, functie en organisatie van grote membraan eiwitcomplexen in de moedertaal van biologische membranen.

Visualisatie van ATP synthase Dimeren in Mitochondriën door Electron Cryo-tomografie

Hier presenteren we een protocol om de oriëntatie en topologie van integrale membraaneiwitten in levende cellen te bepalen. Dit eenvoudige protocol is gebaseerd op de selectieve proteasegevoeligheid van chimaeren tussen het eiwit van belang en GFP.

Het bepalen van membraaneiwit Topologie behulp Fluorescentie protease Protection (FPP)

We ontwikkelden een nieuwe techniek in elektronenmicroscopie, "flash-and-vries," dat de visualisatie van membraan dynamiek met ms temporele resolutie mogelijk maakt. Deze techniek combineert de optogenetic stimulatie van neuronen met hogedruk vriezen. Hier tonen we de procedures en een beschrijving van de protocollen in detail.

Flash-en-Freeze: een nieuwe techniek op Capture Membrane Dynamics met Electron Microscopy

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van oligomere toestand van membraaneiwitten dat gebruik maakt van een inheems celmembraan nanodeeltjessysteem in combinatie met elektronenmicroscopie.

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Dit protocol beschrijft een iSCAT-gebaseerde beeldverwerking en single-particle tracking-benadering die het gelijktijdige onderzoek van de moleculaire massa en het diffusieve gedrag van macromoleculen die interageren met lipidemembranen mogelijk maakt. Stapsgewijze instructies voor monstervoorbereiding, massa-naar-contrastconversie, filmacquisitie en nabewerking worden gegeven naast aanwijzingen om mogelijke valkuilen te voorkomen.

Massagevoelige deeltjestracking om membraangeassocieerde macromolecuuldynamica te karakteriseren

Dit protocol beschrijft hoe TIRF-microscopie kan worden gebruikt om individuele ionkanalen te volgen en hun activiteit in ondersteunde lipidemembranen te bepalen, waardoor het samenspel tussen laterale membraanbeweging en kanaalfunctie wordt gedefinieerd. Het beschrijft hoe de membranen moeten worden voorbereid, de gegevens moeten worden vastgelegd en de resultaten moeten worden geanalyseerd.

Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

Leer hoe je de binding van extrinsieke membraaneiwitten op nanodiscs visualiseert met negatieve kleuring transmissie-elektronenmicroscopie. Deze methode onthult eiwit-membraaninteracties en biedt inzichten voor structurele biologie en medicijnontwikkeling.

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Meer video's verkennen