Snelle, enzymatische methoden voor versterking van minimale, lineaire sjablonen voor eiwitprototypering met behulp van celvrije systemen

Dit protocol is belangrijk omdat het beschrijft hoe snel grote hoeveelheden DNA-sjabloon kunnen worden gegenereerd voor gebruik in celvrije reacties van een klein genfragment ontvangen van een synthesefaciliteit. Rolling circle amplification kan sneller grote hoeveelheden DNA genereren dan traditioneel klonen. Het ondersteunt dus hogere doorvoer ontwerp build test leercycli uit bibliotheken van synthetisch DNA.

Deze technieken kunnen een grote inherente variabiliteit hebben voor nieuwe gebruikers vanwege de vele stappen en kleine volumes die nodig zijn. Er moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan de techniek en oefening baart kunst. Voeg om te beginnen alle componenten uit een PCR-kit toe aan één PCR-buis.

Voeg vervolgens één microliter van het geresuspendeerde genfragment toe. Homogeniseer het mengsel voorzichtig door gedurende vijf tot 10 seconden op een medium stand te vortexen. Na het programmeren van de thermocycler volgens het protocol van de kitfabrikant, voert u de PCR uit.

Gebruik na voltooiing van de PCR een PCR-opruimkit om het DNA uit de reactiemix te zuiveren. Voeg in een buis van 1,5 milliliter de DNA-bindingsbuffer en het PCR-monster toe in een verhouding van vijf op één. Breng dit mengsel over in de spinkolom en centrifugeer gedurende één minuut bij 16.000 maal G.

Gooi de doorstroming weg. Voeg 200 microliter van de DNA-wasbuffer toe aan de kolom en incubeer deze gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer de kolom opnieuw en gooi de doorstroming weg.

Was de kolom nogmaals met de DNA-wasbuffer, zoals aangetoond. Nadat u de doorstroom van de tweede wasbeurt hebt weggegooid, verwijdert u de resterende buffer door de kolom nog eens één tot twee minuten te centrifugeren. Om het DNA te elueren, breng je de kolom over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter.

Voeg vervolgens 46 microliter dubbel gedestilleerd water toe aan de kolom. Na een incubatie van één minuut verzamelt u het DNA in de buis door middel van centrifugering. En kwantificeer het gezuiverde DNA met behulp van een spectrofotometer.

Om het DNA te verteren en te circulariseren, combineert u vijf microliters van de benodigde reactiebuffer, 20 eenheden van het HindIII-restrictie-enzym en 45 microliter van het gezuiverde DNA in een PCR-buis. Gebruik een pipet en homogeniseer dit mengsel voorzichtig. Incubeer het vervolgens in een thermocycler gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.

Nadat de incubatie is voltooid, inactiveert warmte het HindIII-enzym door gedurende 20 minuten bij 80 graden Celsius te broeden. Voeg vervolgens vijf microliter T4 Ligasebuffer en 800 eenheden T4 Ligase toe aan het nieuw verteerde DNA. Na voorzichtig mengen met een pipet, incubeer het mengsel gedurende een uur bij 25 graden Celsius om de circularisatiereactie uit te voeren.

Zodra de reactie is voltooid, zuivert u het DNA met behulp van een PCR-opruimkit zoals eerder is aangetoond. Kwantificeer vervolgens het DNA. Om de rolling circle-versterking uit te voeren, combineert u alle reactiecomponenten en één microliter van de gezuiverde gecirculeerde expressiesjabloon in één buis.

Homogeniseer het mengsel met een pipet en aliquot 10 microliter van het mengsel in vier afzonderlijke buizen. Incubeer de buizen bij 30 graden Celsius gedurende vier tot 18 uur en inactiveer vervolgens het enzym door gedurende 10 minuten bij 65 graden Celsius te broeden. Na warmte-inactivatie, stimuleer condensatie aan de onderkant van de buis door gedurende vijf minuten te broeden bij 12 graden Celsius.

Verdun vervolgens de resulterende oplossing door 15 microliter dubbel gedestilleerd water aan elke buis toe te voegen. Combineer de inhoud van elke buis voordat u het DNA zuivert en kwantificeert zoals eerder is aangetoond. Om de celvrije reactie uit te voeren, voegt u de verschillende vereiste componenten toe aan een buis en verdunt u tot het uiteindelijke gewenste volume met dubbel gedestilleerd water.

Meng de oplossing grondig door de helft van de oplossing 10 tot 20 keer op en neer te pipetteren. Breng het reactiemengsel in aliquots van 15 microliter over in de gewenste putjes in de microtiterplaat. Sluit vervolgens de plaat af met een kleurloze afdichtingsfolie om de luchtvochtigheid te behouden en verdamping te voorkomen.

Plaats de verzegelde plaat in de plaatlezer en laat de reactie doorlopen tot voltooiing. Bij het tot expressie brengen van het subtilisine BPN-gen met behulp van het celvrije systeem, aliquot 94 microliter dubbel gedestilleerd water en één microliter van 10 micromolair PNA in een vlakke bodem, kleurloze 96 putplaat. Voeg vervolgens vijf microliter van de voltooide celvrije reactie toe en lees de plaat met behulp van een plaatlezer die is ingesteld om de absorptie op 410 nanometer elke 20 seconden gedurende 10 minuten te meten met behoud van een temperatuur van 25 graden Celsius.

De expressie van de Superfolder GFP in het BL21 DE3-sterextract met slechts 3 microliter ongezuiverd RCA-DNA in een reactie van 15 microliter is vergelijkbaar met die van het PJL1-plasmide. Het verdubbelen en verdrievoudigen van de hoeveelheden sjabloon lijkt geen duidelijk voordeel te bieden, wat suggereert dat de sjabloon al verzadigd is met 3 microliter per reactie. Omgekeerd lijkt er een voordeel te zijn aan het verhogen van de hoeveelheid RCA-sjabloon bij gebruik van het shuffle-stamcelextract.

Eiwitten die lagere temperaturen of langere vouwtijden vereisen, beïnvloeden de tijd die nodig is om de hele workflow te voltooien. Het testen van subtilisine na vier uur expressie leidt bijvoorbeeld tot een mislukt resultaat, omdat vier uur niet genoeg is voor subtilisinerijping. Het toestaan van de reactie om door te gaan tot 16 uur leidt echter tot detecteerbare niveaus van subtilisine.

Alle componenten moeten goed worden gemengd om dit protocol maximaal efficiënt te laten werken. Volgens deze methoden kan een grote bibliotheek van eiwitkandidaten synthetisch worden gegenereerd en vervolgens worden uitgedrukt met voldoende opbrengst voor karakterisering. Deze methode maakte de weg vrij voor onze groep om N C twee sensoren te ontwikkelen die kunnen werken in celextracten, waardoor we het prototype-eiwit snel kunnen karakteriseren.

Dit zal ons in staat stellen om sneller en intelligenter te itereren op eiwitontwerp van nieuwe biokatalysatoren en therapieën.