Studies van Chaperone-Cochaperone Interacties met behulp van Homogene Bead-Based Assay

We bouwden een homogene op kralen gebaseerde test om chaperone-cochaperone-interacties te bestuderen. Met behulp van deze techniek screenen we kleine moleculen die interacties tussen Hsp90 en FKDP51 of FKBP52 remmen en identificeren we krachtige en selectieve remmers. Deze high throughput screening techniek is robuust en betrouwbaar.

Resultaten kunnen binnen een uur worden verkregen en het vereist slechts kleine hoeveelheden kraleneiwit en verbindingen. Hsp90-interactie met deze cochaperones was betrokken bij menselijke aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer, kanker, auto-immuunziekte. Deze techniek biedt de mogelijkheid om chaperonne-cochaperonremmers met een hoog medisch belang te screenen.

Hier is het basisprincipe van deze test. Wanneer de interactie tussen Hsp90C-Terminal peptide en TPR-domein van cochaperones de donor- en acceptorparels in de buurt brengt, wordt een sterk versterkt signaal gegenereerd. Wanneer de interactieremmers worden toegevoegd, kunnen de donor- en acceptorparels de nabijheid niet bereiken en wordt er geen detecteerbaar signaal geproduceerd.

Begin met het verdunnen van het Hsp90-peptide in PBS bij een concentratie van één milligram per milliliter. Verdun de ongeconjugeerde acceptorkralen in PBS en breng de kralen over in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de verdunde kralen voor het wassen en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant.

Voor conjugateren stelt u de acceptorparels in peptiden in op een verhouding van 10 tot 1. Aan de paletide kralen bij PBS verdunde peptide, Tween 20 en Natrium cyanaboroughhydride oplossing, en incubeer met eind over eind agitatie op een roterende shaker. Om de niet-gereageerde plaatsen te blokkeren, voegt u 20 microliter van één molaire Tris-hydrochlorideoplossing van pH 8,0 toe aan de kralen en dooft u de reactie door gedurende één uur bij 37 graden Celsius te broeden.

Was aan het einde van de incubatie de kralen door centrifugering en suspensie de kraalkorrel opnieuw in één milliliter Tris-hydrochlorideoplossing. Herhaal het wassen nog twee keer. Na de laatste wasbeurt suspensie de kralen opnieuw met een concentratie van één milligram per milliliter in de opslagbuffer en bewaart u de geconjugeerde acceptorkraaloplossing bij 4 graden Celsius beschermd tegen licht.

Voeg glutathiondonorparels toe bij een concentratie van 10 microgram per milliliter in PBS. Voeg GSTFKBP51 toe aan een eindconcentratie van 10 microgram per milliliter en incubeer de reactie gedurende 10 minuten bij 25 graden Celsius in het donker. Maak seriële verdunningen van de teststof in DMSO.

Voeg 0,25 microliter verdunningen van de testcompound toe en drievoud in de hoek van elke put van een put van 384 putjes. Voeg voor negatieve controle 0,25 microliter DMSO toe en voor positieve controle 0,25 microliter Hsp90 C-Terminal peptide in de putjes. Voeg 22,5 microliter van de oplossing die glutathiondonorparels met GST-gelabelde eiwitten bevat, toe aan elke put.

Schud het bord grondig met de handen en incubeer in het donker bij 25 graden Celsius gedurende 15 minuten. Verdun de acceptorparels met het daaraan gehechte Hsp90C-Terminal peptide tot 100 microgram per milliliter concentratie in 0,5 maal PBS. Voeg 2,25 microliter verdunde acceptorkralen toe aan elk putjes.

Schud en incubeer de plaat in het donker gedurende 15 minuten zoals gedemonstreerd. Schakel het plaatlezerinstrument in, meet het signaal van de plaat en analyseer de gegevens zoals beschreven in het teksthandschrift. Maak een X-Y-gegevenstabel in het welkomstdialoogvenster, selecteer X-getallen, Y en voer drie replicatiewaarden in naast elkaar kolommen in.

Importeer de concentratiewaarden in de X-kolom en de signaalwaarden in de Y-kolom. Klik op analyseren, selecteer transformatieconcentratie X en selecteer vervolgens transformeren naar logaritmen. Klik op analyseren en kies niet-lineaire regressie onder X-Y-analyse.

Open de dosisresponsremmingsoptie en kies log versus respons variabele hellingsvergelijking. Klik op OK om de resultaten met IC50-waarde en grafieken te bekijken. Deze test werd gebruikt voor het screenen van kleine moleculen, waardoor interacties tussen Hsp90 en FKBP51 of FKBP52 werden geremd.

De Z-score van meer dan 0,8 en de signaal-achtergrondverhouding van 13,35 tonen de robuustheid en betrouwbaarheid voor screening met hoge doorvoer. Het effect van kleine molecuulgewicht testverbinding D10 op remming van chaperone-cochaperone interacties werd beoordeeld en IC50 waarden werden berekend, waarbij D10 dosisafhankelijke remming liet zien. De IC50-waarde voor Hsp90 GSTFKBP51-interacties was 65 nanomolair.

Terwijl voor Hsp90, GSTFKBP52 interacties, volledige remming niet werd bereikt met de hoogste samengestelde concentratie geeft aan dat selectieve remming van eiwit-eiwit interactie met kleine moleculen kan worden bereikt. De kritieke stap is de volgorde van toevoeging. We vormen eerst een complex tussen een klein molecuul en zijn TPR-doelwit.

Anders zijn langere incubatie en hogere samengestelde concentraties vereist. We kunnen deze techniek gebruiken om te screenen op kleine moleculen die de interactie tussen Hsp90 en FKB51 of Hsp90 en FKB52 verstoren. Het kan ook worden uitgebreid tot elke interactie tussen Hsp90, Hsp70 en een TPR-motief dat cochaperonscreening selectieve remmers bevat.