Voorbijgaande transductie van de gestrobileerde vormen van Echinococcus granulosus

Voorbijgaande transactie van de gestroopte vormen van Echinococcus granulosus. We beschrijven een snelle transiënte transductietechniek in verschillende ontwikkelingsstadia van Echinococcus granulosus met behulp van lentivirale vectoren van de derde generatie. Cystische echinokokkose of hydatidziekte is een van de belangrijkste zoönotische parasitaire ziekten veroorzaakt door Echinococcus granulosus, een kleine lintworm in de darm van honden.

Er is dringend behoefte aan toegepast genetisch onderzoek om de mechanismen van pathogenese en ziektebestrijding en -preventie te begrijpen. Het ontbreken van een effectief genevaluatiesysteem belemmert echter de directe interpretatie van functionele genetica van cestodeparasieten, waaronder Echinococcus-soorten. Vooruitgang in genoverdracht bij parasitaire platwormen is nog steeds beperkt in vergelijking met protozoaire parasiet.

Het gebruik van virale toedieningssystemen is de afgelopen twee decennia naar voren gekomen als een essentieel hulpmiddel voor transgene levering en gen / eiwitonderzoek. Dus evalueerden we de lentivirale transiënte transductie van het GFP reporter-gen naar de protoscoleces en gestrobileerde wormen van Echinococcus granulosus. Figuur 1 toont een schematische presentatie van het onderzoeksprotocol voor Echinococcus granulosus-stadia.

Eén, het verzamelen van hydatid cysten. Verzamel leverhydatid cysten van natuurlijk geïnfecteerde schapen die routinematig worden geslacht in een slachthuis. Steriliseer het cysteoppervlak volledig met steriel gaas en 70% alcohol voordat u de protoscoleces aanzuigt.

Aspirateer 20 tot 50 ml hydatidvloeistof uit in steriele conische buisjes van 50 ml. Na het draineren, veeg de cyste uit met een scherp mes, breng de kiemlaag over in een steriele conische buis van 50 ml en schud deze gedurende een korte periode om de verzameling protoscoleces te vergroten. Was de protoscoleces met PBS-buffer drie tot vijf keer.

Observeer de protoscoleces in 0,1% eosine gedurende vijf minuten om de levensvatbaarheid van de protoscoleces onder een lichtmicroscoop te bepalen. Gebruik protoscoleces met een levensvatbaarheid van ten minste 95% voor cultuur. Behandel de protoscoleces neerslaan met twee ml pepsine gedurende 15 tot 20 minuten.

Om individuele protoscoleces te isoleren, resuspendeert u het protoscoleces-sediment in PBS en voert u het door twee lagen steriel gaas in een nieuwe steriele conische buis van 50 ml. Twee, bifasische teelt van protoscoleces van Echinococcus granulosus om volwassen wormen te verkrijgen. Voeg 10 ml van het vloeibare fasemedium toe aan elke kweekkolf van 25 centimeter in het kwadraat.

Voeg ongeveer 5.000 protoscoleces toe aan de kweekkolf en breng deze over in de CO2-incubator. Breng na 24 tot 48 uur de protoscoleces over in een nieuwe kolf met de vaste fase en voeg één ml van hetzelfde verse vloeibare fasemedium per kolf toe. Breng de kolven over in de incubator, 37 graden Celsius, 5% CO2.

Vervang om de vijf tot zeven dagen het medium door een vers vloeibaar fasemedium. Drie, monofasische teelt van protoscoleces van een Echinococcus granulosus. Zorg ervoor dat monofasische teelt 24 tot 48 uur vóór de transductie wordt gedaan.

Kweek ongeveer 5.000 protoscoleces in een 25 centimeter vierkante kweekkolf met RPMI en 10%FBS. Breng de kolven over in de CO2-incubator tot gebruik. Vier, celkweek voor virusproductie en -bereiding.

Breng 500.000 HEK-cellen over naar een kolf van 25 centimeter in het kwadraat met 5 ml DMEM met 10% FBS, 100 U / ml penicilline en 100 microgram / ml streptomycine. Incubeer de HEK2-cellen bij 37 graden Celsius in 5% CO2 en passeer ze elke 48 uur in het volledige kweekmedium. Gebruik ten slotte hek-cellen met lage doorgang voor transductie.

Vijf, productie en bereiding van het virus met de derde generatie lentivirale vectoren. Dag één, na het trypsiniseren van de HEK-cellen in een 6-well kweekplaten, zaai 70.000 cellen per put met verse antibioticavrije DMEM die 10% FBS bevat. Gebruik cellen met 50 tot 60% samenvloeiing voor transductie door de calciumfosfaatmethode.

Dag twee, vervang het celkweekmedium twee tot drie uur voor het experiment door verse antibioticavrije DMEM met 2% FBS. Meng in een buis van 1,5 ml lentivirale plasmiden van de derde generatie, waaronder 7 microgram /microliter pCDH513b transfervector, 4 microgram / microliter PLPII, 4 microgram / microliter PLPI en 2 microgram / microliter PMD2G-helpervectoren. Voeg de HEPES-buffer toe aan het mengsel om het volume van 422 microliter te bereiken.

Voeg 16 microliter 1% TE-buffer toe aan het mengsel. Voeg 62 microliter 2,5 ml calciumchloride toe aan de buisjes en meng goed. Voeg 500 microliter 2x HBS-buffer toe aan het mengsel, druppel voor druppel binnen één tot twee minuten met behulp van een Pasteur-pipet.

Meng voorzichtig tot een half-ondoorzichtige oplossing is verkregen en incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde het mengsel langzaam toe aan elke plaat en verdeel het met langzame cirkelvormige bewegingen. Incubeer de platen bij 37 graden Celsius in een 5% CO2-incubator en vervang het medium na vier tot zes uur door antibioticavrije DMEM met 10% FBS.

Dag drie, bevestig succesvolle transiënte transductie en levensvatbaarheid van cellen met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Dag vier, oogst virussen uit het kweekmedium door het supernatant van elke put te verzamelen en bewaar ze bij negatieve 70 graden Celsius tot gebruik. Zes, voorbijgaande transductie van verschillende stadia van Echinococcus granulosus met het virus.

Gebruik op de eerste dag een kweekplaat met 12 putten voor genoverdracht. Kweek 5.000 tot 50.000 HEK-cellen in drievoud met een compleet DMEM-medium als interne referentie. Cultuur 150 verse protoscoleces in drievoud in RPMI en 10%FBS.

Kweek 30 gestroopte wormen in drievoud tot DMEM en 10% warmte-geïnactiveerde FBS. Bereid een mengsel van 1 miljoen virussen met vier microgram/ml transfectiereagens om de HEK-cellen en verschillende stadia van de worm te transduceren. Voeg het mengsel langzaam toe aan elke plaat en verdeel het met langzame cirkelvormige bewegingen.

Incubeer de platen gedurende vier tot zes uur in een CO2-incubator, 37 graden Celsius, 5% CO2. Vervang het medium voor elk monster door hetzelfde volledige kweekmedium om de toxische effecten van de transfectiereagentia te minimaliseren. Dag twee, herhaal twee eerdere stappen om de efficiëntie van transiënte transductie voor de HEK-cellen, protoscoleces en gestrobileerde wormen te verhogen.

Incubeer alle platen gedurende 24 tot 48 uur in een CO2-incubator met dezelfde kweekomstandigheden op basis van het type celmedia. Dag drie, zorg ervoor dat de transductie succesvol is met behulp van fluorescentiemicroscopie. Representatieve resultaten.

Hier beschrijven we een snelle en efficiënte transiënte transductietechniek in Echinococcus granulosus door gebruik te maken van lentivirale vectoren van de derde generatie. We kweekten protoscoleces in bifasische kweekmedia om gestrobileerde wormen te verkrijgen volgens onze eerdere studies. Protoscoleces worden ontwikkeld tot de gestrobileerde wormen na een in vitro kweek van zes weken.

Verschillende stadia van Echinococcus granulosus werden waargenomen in het bifasische kweekmedium, waaronder invaginated protoscoleces, Figuur 2A, geëvacueerde protoscoleces, Figuur 2B, en gestrobileerde wormen met eerste en derde proglottide vorming, Figuur 2C tot en met E.Protoscoleces en de gestrobileerde wormen verkregen uit respectievelijk monofasische en bifasische teelten, werden getransfecteerd door GFP-expresserende lentivirussen, Figuur 3. HEK-cellen drukten GFP duidelijk uit als transiënte transductieprocescontrole. De volwassen wormen drukten GFP het duidelijkst uit in de tegumentale laag.

Protoscoleces hebben echter na 48 uur een iets lager niveau van GFP-expressie aangetoond. Sommige cystevloeistofresten en of kiemlaagresten rond de protoscoleces veroorzaakten enige fluorescentieachtergrond in de getransfecteerde monsters. De intensiteit van fluorescentie in HEK-cellen en gestrobileerde wormen nam na 24 en 48 uur toe.

Het begrijpen van de moleculaire basis van nematoden en Platyhelminthes biologie is een van de belangrijkste grenzen in de pathogeniciteit van zoönotische parasieten. Het ontbreken van een effectief genevaluatiesysteem is een groot obstakel voor directe interpretatie van functionele genetica van cestodeparasieten, waaronder Echinococcus-soorten. Het belangrijkste doel van dit werk was om het proces van lentivirale vectortransductie te illustreren dat van cruciaal belang zal zijn in toekomstig Echinokokkose-onderzoek.

De resultaten tonen aan dat gestrobileerde wormen beter reageren op voorbijgaande transductie van het gen dan de protoscoleces, wat het gevolg kan zijn van een uitgebreide tegumentale structuur in de gestrobileerde vormen. Vanwege de aard van lentivirale transductie is de fluorescentie-intensiteit in de meercellige protoscoleces en gestroopte wormen echter meestal veel lager dan monolaagse HEK-cellen. Er is dringend behoefte aan toegepast genetisch onderzoek op genomisch en transcriptomisch niveau voor Echinococcus, evenals een breed scala aan parasitaire en vrijlevende platwormmodelsystemen.

Daarom maakt het ontwikkelen van het genoverdrachtsproces naar lintwormen de weg vrij voor mogelijk gebruik van de nieuwe technieken zoals virusgebaseerde genmapping of CRISPR-Cas9-gemedieerde genbewerking. Dit werk presenteert lentivirale transductie in een lintwormmodel en toont veelbelovende resultaten met potentiële implicaties voor de biologie van platwormen. Toch zijn meer diepgaande studies nodig om de methoden te verbeteren en de toepasbaarheid van deze technieken voor toekomstige experimenten te ontwikkelen.