Diepe en ruimtelijk gecontroleerde volume-ablaties met behulp van een twee-fotonenmicroscoop in de zebravis Gastrula

In de embryo's interageren cellen met elkaar en wisselen ze chemische en mechanische informatie uit. Een efficiënte manier om deze interacties te onderzoeken, is door sommige cellen te doden en de gevolgen voor naburige cellen te volgen. De methode die we beschrijven stelt ons in staat om cellen nauwkeurig te aborteren, zelfs in het embryo, zonder naburige weefsels te beschadigen.

Bereid de microscoop met twee fotonen voor door de eerste laser in te stellen op de ablatiegolflengte 820 nanometer en de tweede laser op de mCherry-beeldvormingsgolflengte 1.160 nanometer. Gebruik beweegbare spiegels op het optische pad, lijn de twee laserstralen uit bij het in- en uitstappen van de scankoppen en meet vervolgens het maximale vermogen van de eerste laser op 820 nanometer. Plaats de vermogensmeter onder het objectief, sluit de zwarte kamer en stel het eerste laservermogen in op 100% Start de gegevensverzameling op de vermogensmeter, open de lasersluiter en meet vervolgens het uitgangsvermogen en bereken het percentage laservermogen dat nodig is om 300 milliwatt te bereiken.

Stel de eerste laser in op de GFP-excitatiegolflengte van 920 nanometer en het vermogen op 7% Pas het tweede laservermogen aan op 15% Activeer de PMT-detectoren voor groene en rode lijnen en stel de PMT-gevoeligheid van de groene en rode lijn in op 65. Pas het gezichtsveld aan op 400 bij 400 micrometer, de beeldresolutie op 512 bij 512 pixels en de scanfrequentie op 800 hertz. Selecteer de 3D timelapse-beeldvormingsmodus, maak vervolgens een map en activeer Automatisch opslaan om gegevens op te slaan na elke acquisitie.

Monteer de verwarmingskamer en stel deze in op 28 graden Celsius. Wacht minstens 10 minuten tot de kamer en het doel opwarmen. Identificeer onder een fluorescentieseomicroscoop embryo's met 70% epibolie die GFP tot expressie brengen.

Ze brengen met behulp van een plastic Pasteur-pipet drie tot vier geselecteerde embryo's over in de met agarose beklede schaal en dechorioneren ze zorgvuldig met een fijne tang. Voeg in een kleine glazen injectieflacon een milliliter van een oplossing van penicilline-streptomycine embryomedium toe dat 2% agarose bevat en plaats de injectieflacon in een voorverwarmde, droge blokverwarmer bij 42 graden Celsius. Breng met behulp van een vuurgepolijste glazen pipet een gedechorioneerd embryo over naar de injectieflacon, waarbij u ervoor zorgt dat u niet te veel embryomedium aan de agarose toevoegt.

Gooi het resterende embryomedium uit de pipet. Adem het embryo terug, samen met voldoende agarose om de glijbaan van de glazen bodemschaal te bedekken. Blaas de agarose met het embryo op de glazen dia van de schaal, zodat het embryo de lucht of de plastic kant van de schaal niet raakt.

Vul vervolgens de kamer rond de glasplaat met agarose. Gebruik een wimper om het embryo zo te oriënteren dat het beoogde gebied zich bovenaan bevindt. Voeg na vijf minuten, wanneer de agarose volledig is ingesteld, een paar druppels penicilline-streptomycine embryomedium toe aan de glasplaat.

Plaats de glazen bodemschaal onder het objectief in de verwarmde kamer. Dompel het doel onder in penicilline-streptomycine embryomedium voordat u de kamer sluit. Verplaats de schuifregelaar om het lichtpad in te stellen op een oculair.

Zet het fluorescentielampje aan. Zoek een embryo en stel de focus op de oppervlakte. Schakel het fluorescentielampje uit en stel het lichtpad in op PMT's voordat u de zwarte kamer sluit.

Start live beeldvorming en lokaliseer het axiale mesoderm. Om een goed signaal te hebben, past u de laservermogens aan. Gebruik het rode kanaal om het podium naar de top van het embryo te verplaatsen en wijs deze positie toe als Z gelijk is aan nul.

Kies een tijdstap van één minuut en een Z-stap van twee micrometer. Zet de eerste plak op 15 micrometer boven het axiale mesoderm en de laatste plak op 15 micrometer onder het axiale mesoderm. Neem 10 tot 15 minuten van een pre-ablatiefilm op.

Zoek bij live beeldvorming de polstercontour en teken vervolgens met behulp van het interessante elektro-optische modulatorgebied of het gereedschap EOM-ROI een rechthoek van 20 pixels groot die de breedte van de polster overspant en plaats de rechthoek in het midden van de polster. Let op de axiale positie van de hoogste en laagste vlakken die moeten worden opgeblazen, zodat de ROI op geen van de vlakken de dooiercel overlapt. Plaats het podium op de laagste Z-stand die moet worden geableerd.

Stel de eerste lasergolflengte in op 820 nanometer en voer het eerder berekende vermogenspercentage in om een uitgangsvermogen van 300 milliwatt te verkrijgen. Stel de beeldfrequentie in op 200 hertz en de eerste laserbeeldvorming EOM op nul. Nadat u de ROI-behandelingsmodus hebt geselecteerd, schakelt u de EOM uit en stelt u de behandeling in om onmiddellijk na nulframe te starten.

Zet de beeldmodus op Timelapse en deactiveer Automatisch opslaan. Nadat u de snelle modus hebt geselecteerd in de tijdstap, past u het aantal behandelingsframes en het aantal frames aan op de waarde die overeenkomt met de beoogde diepte. Begin met beeldvorming.

De overname moet zwart zijn, omdat de sluiter naar PMT sluit tijdens de EOM-behandeling. Ga vervolgens het podium op naar de volgende Z-positie en voer op dezelfde manier ablatie uit. Herhaal dit op elke Z-positie totdat de bovenkant van de polster is bereikt.

Wanneer het ablatieproces is voltooid, stelt u de eerste laser in op 920 nanometer en past u zich aan het eerder gekozen beeldvermogen aan. Zet de eerste laser imaging EOM op 100 en kies voor de Full field modus. De beeldfrequentie moet 800 hertz zijn en EOM moet worden uitgeschakeld voordat de hele stapel in live-modus wordt onderzocht om te controleren of elk vliegtuig is geableerd.

Zodra de ablatie is bevestigd, selecteert u 3D Time lapse als beeldmodus. Activeer Automatisch opslaan opnieuw en begin met het opnemen van de film na de ablatie gedurende 40 tot 60 minuten. Controleer in de post-ablatiefilm of de beoogde cellen effectief waren geableerd.

Omdat ablaties over de polsters geen schade mogen toebrengen aan embryo's, kan de normale morfologie van de geableerde embryo's tot 24 uur na de bevruchting worden waargenomen. Bij de succesvolle uitkomst van laserablaties werden de overlappende weefsels niet beïnvloed door de ablatie van onderliggende structuren. Een te intensieve behandeling, of te weinig behandeling, resulteerde in storingen in laserablatie.

Een voorbeeld van mislukte ablatie toont cellen boven de polster die worden geableerd, wat duidelijk was door autofluorescenterend puin in het brandpuntsvlak boven de polster. In een andere ineffectieve poging werden cellen gebleekt maar niet geableerd, en lage fluorescentiesignalen onthullen nog steeds de intacte celcontouren. Ten slotte werden sommige cellen niet eens gebleekt vanwege onvoldoende laserbehandeling.

De vorming van bubbels is te wijten aan cavitatie geïnduceerd door een te intense laserbehandeling. Z-stacks werden elke minuut gedurende 40 minuten gevangen in een succesvolle ablatie, waarbij zowel de cytoplasmatische GFP als de nucleaire mCherry-signalen werden geregistreerd. Bovendien worden kernen die behoren tot de voorste helft van de polster gemarkeerd met een magenta-stip en gevolgd in de tijd, voor en na ablatie.

Als maat voor migratiepersistentie werd de richtingsautocorrelatie van cellen voor en na ablatie bestudeerd. Cellen die tot het voorste deel van de polster behoorden, vertoonden een aanhoudende beweging vóór ablatie, die drastisch afneemt na ablatie, wat wijst op een verlies van collectief georiënteerde migratie. Het goed uitlijnen van de lasers en het meten van het laservermogen zijn van cruciaal belang om reproduceerbare resultaten te krijgen.

Het is ook belangrijk om de ablatie-efficiëntie te controleren op de eerste post-ablatiebeelden. We gebruiken laserablaties om de rol van cel-celinteracties bij het begeleiden van de migratie van cellen in het embryo in twijfel te trekken. Maar de procedure kan gemakkelijk worden aangepast aan vele andere vragen waarbij cellen of weefsels precies moeten worden geableerd, mogelijk diep in het organisme.